水貂綠膿桿菌血清g型菌株及其滅活疫苗和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及水貂綠脈桿菌，尤其設(shè)及一株水貂綠脈桿菌血清G型菌株，本發(fā)明進(jìn)一 步設(shè)及用該菌株制備的預(yù)防水貂出血性肺炎的滅活疫苗，屬于水貂綠脈桿菌的分離和應(yīng)用 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水貂出血性肺炎是由綠脈桿菌(又稱銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa)感 染引起的一種高度致死性傳染病，多發(fā)于每年9至11月份，該菌可通過患病水貂形成的飛沫 及氣溶膠傳播。發(fā)病急、死亡快，所W又稱銅綠假單胞菌肺炎，W呼吸困難、口鼻出血、突發(fā) 性死亡為主要特征，死后典型癥狀為口鼻流出血樣泡沫，剖檢肺臟呈彌漫性出血。
[0003] 綠脈桿菌，屬于丫變性菌口假單胞菌科，為需氧或兼性厭氧菌的革蘭氏陰性桿菌。 目前對綠脈桿菌分型常用方法是血清學(xué)分型，國際血清分型系統(tǒng)根據(jù)菌體0抗原將其分為 20個不同的血清型。日本科學(xué)家化mma根據(jù)0抗原將綠脈桿菌分為A~N群，并且根據(jù)此系統(tǒng) 形成的試劑盒在國際社會形成廣泛應(yīng)用。
[0004] 綠脈桿菌為條件致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，接種疫苗是預(yù)防該病的有效方法，同 時避免了使用抗生素導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性。中國于上世紀(jì)80年代初首次報道了水貂出血性 肺炎病例，此后相繼有該病報道，調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國各地水貂出血性肺炎WG型為主，流行情況 為60 %~80 %不等，其次是B型和C型，由于各血清型之間無交叉保護(hù)，制備的單苗具有針對 性。因此，研制一種防治水貂出血性肺炎的安全性好、保護(hù)效力高的滅活疫苗具有重要的現(xiàn) 實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是提供一株致病力強(qiáng)、穩(wěn)定性高的水貂綠脈桿菌血清G型菌株；
[0006] 本發(fā)明的目的之二是將所分離的水貂綠脈桿菌血清G型菌株應(yīng)用于防治水貂出血 性肺炎。
[0007] 本發(fā)明的目的之Ξ是提供一種制備防治水貂出血性肺炎的滅活疫苗的方法。
[000引本發(fā)明的上述目的是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明從多例疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺臟中，通過分離、鑒定、篩 選、檢測最終得到了 24株血清G型菌株，對24株菌株的致病力進(jìn)行篩選，得到致病力較好的3 株血清G型菌株，對3株菌株穩(wěn)定性進(jìn)行篩選最終得到了穩(wěn)定性高的水貂綠脈桿菌血清G型 DL012株，已將分離的菌株提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No. 12144;分類命名為：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa。保藏單位：中國微生物保 藏管理委員會普通微生物中屯、;保藏時間是:2016年2月24日：保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0010] 本發(fā)明無菌采集疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺臟，接種2%牛血清肉湯 瓊脂平板，37Γ過夜培養(yǎng)，挑取疑似單菌落劃線接種綠脈素測定用培養(yǎng)基(PDP)，37°C培養(yǎng) 24小時，挑取陽性菌落接種5ml 2 %牛血清肉湯培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)過夜，記為FO代。經(jīng)過PCR 鑒定、16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明：PCR鑒定為陽性，測序結(jié)果與預(yù)期相符，符合 片段大小為956bp。然后對其形態(tài)、生化特性、培養(yǎng)特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，分離株符合綠 脈桿菌的形態(tài)、生化及培養(yǎng)特性，初步鑒定為陽性的菌液。對初步鑒定為陽性的菌液進(jìn)行血 清型鑒定檢測，篩選出24株血清G型菌株。然后對血清G型菌株進(jìn)行純化，得到編號化001、 DL002、SD003、DL004JL005、SD006、SD007、WD008、SD009、SD010、SD011、DL012、DL013、 W 朋 14、50015、50016、胖0017、50018、50019、50020、胖0021、50022、50023和50024菌株。然后， 對上述24株血清G型菌株的致病力進(jìn)行篩選，得到致病力較好的3株G型菌株：PL005株、 DL012株和W冊14株。進(jìn)一步對將綠脈桿菌血清G型化005株、DL012株和WH014株的穩(wěn)定性進(jìn) 行篩選，最終得到了穩(wěn)定性高的綠脈桿菌血清G型化012株。
[0011]為了驗(yàn)證本發(fā)明綠脈桿菌血清G型化012株的免疫效力，本發(fā)明對綠脈桿菌血清G 型化012株的毒力和免疫原性進(jìn)行測定，毒力測定表明：綠脈桿菌血清G型化012株對小鼠的 LDso為1.1 X 105CFU;對2~5月齡水貂LDso為9.28 X 104C即。免疫原性測定表明：用該分離株 F1代制備的疫苗免疫2~5月齡水貂5只，免后21日，WlOLDso進(jìn)行攻毒，免疫組保護(hù)率為5/5， 對照組保護(hù)率為0/5。W上結(jié)果表明綠脈桿菌血清G型化012株分離株F1代免疫原性良好。 [0012]進(jìn)一步，本發(fā)明將綠脈桿菌血清G型DL012株制備成Ξ批滅活疫苗，對非祀動物、對 祀動物單劑量和超劑量進(jìn)行安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明：非祀動物、祀動物臨床表現(xiàn)均正常，注 射局部和全身無不良反應(yīng)，全部存活。對滅活疫苗的效力進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明：對于水貂:G 型滅活疫苗免后21日攻毒，Ξ批疫苗對免疫組水貂保護(hù)率均不小于80%，對照組水貂均 100%發(fā)病;對于小鼠：免后21日攻毒，Ξ批疫苗對免疫組小鼠保護(hù)率均不小于90%，對照組 水貂均100%發(fā)病。對免疫持續(xù)期進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明：G型滅活疫苗對水貂抗綠脈桿菌 DL012株的保護(hù)期為6個月，免疫保護(hù)率均不小于80%。W上說明血清G型化012株安全性較 好，能夠提供好的臨床保護(hù)。
[0013] 本發(fā)明還提供了血清G型化012株在制備防治水貂出血性肺炎的應(yīng)用。
[0014] 為此，本發(fā)明提供了一種防治水貂出血性肺炎的疫苗組合物，包括:預(yù)防或治療上 有效量本發(fā)明所分離的綠脈桿菌血清G型化012菌株W及藥學(xué)上可接受的佐劑。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備所述防治水貂出血性肺炎的疫苗組合物的方法，該 方法包括：
[0016] (1)培養(yǎng)綠脈桿菌血清G型DL012株，得到菌液；
[0017] (2)向菌液中加入滅活劑，將菌液滅活；
[0018] (3)滅活后的菌液與佐劑混合均勻，配苗，即得。
[0019] 步驟（1)中將血清G型化012株接種含2%牛血清肉湯瓊脂平板，37°C過夜培養(yǎng)，挑 取單個典型菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按培養(yǎng)基體積總量的1 %接種TSB培養(yǎng)基，37 Γ通氣攬拌培 養(yǎng)；
[0020] 步驟(2)中向菌液中加入的滅活劑是甲醒，加入甲醒至其終濃度為菌液體積總量 的0.1 %，滅活24小時。
[0021] 步驟(3)中，所述的佐劑為氨氧化侶膠，其中，氨氧化侶膠為體積百分比為30%氨 氧化侶膠。
[0022] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下有益效果：
[0023] 本發(fā)明所分離的水貂綠脈桿菌血清G型化012菌株致病力強(qiáng)、穩(wěn)定性高，其制備的 滅活疫苗具有較高的安全性和良好的免疫效力，對于綠脈桿菌所致的水貂出血性肺炎能夠 提供好的臨床保護(hù)，能有效預(yù)防水貂出血性肺炎。
[0024] 本發(fā)明所設(shè)及到的術(shù)語定義
[0025] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0026] 術(shù)語"疫苗"意指將病原微生物(如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過 人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。
[0027] 術(shù)語"佐劑"意指非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時，可 增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。
[0028] 術(shù)語"免疫"意指機(jī)體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質(zhì)，并通過免疫應(yīng)答排除抗原性 異物，W維持機(jī)體生理平衡的功能。
[0029] 術(shù)語"免疫原性"意指能夠刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋己細(xì)胞的能力，即指抗 原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)抗體和致 敏淋己細(xì)胞的特性，也指抗原刺激機(jī)體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)能形成抗體或致敏T淋己細(xì)胞的特 異性免疫反應(yīng)。
【附圖說明】
[0030] 圖1為分離株16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中:M:DL 2000Marker;l:分離株； 2:陽性對照;3:陰性對照；
[0031] 圖2為綠脈桿菌血清G型化005、化012、W冊14的F1代在傳代過程中菌體含量變化。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和 形式進(jìn)行修改或替換，但運(yùn)些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033] 1、試驗(yàn)材料
[0034] 1.1主要試劑
[0035] rTaq、dNTP、DL2000DNA Marker、pMD18-T載體和D冊α均購自寶生物工程（大連）有 限公司；膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；瓊 脂糖購自生工生物工程（上海）有限公司；氨節(jié)（Amp+)購自Sigma公司；甘油、甲醒溶液和 NaCl均購自國藥集團(tuán)。
[0036] 1.2培養(yǎng)基
[0037] LB培