減毒豬霍亂沙門氏菌S.Choleraesuis S1210及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及減毒豬霍亂沙門氏菌S.Choleraesuis S1210 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著新老傳染病的不斷流行，研究和開發(fā)有效防治傳染病的方法顯得極為迫切。 在過(guò)去兩百多年中，疫苗在防止細(xì)菌或病毒性傳染病中發(fā)揮了巨大的作用。由于疫苗相對(duì) 于大多數(shù)藥物而言，具有使用成本低的優(yōu)勢(shì)，因此，不斷的研究和開發(fā)疫苗是十分必要的。
[0003] 在疫苗研究領(lǐng)域中，利用沙門氏菌作為載體已經(jīng)得到了廣泛的研究。然而，目前對(duì) 沙門氏菌，特別是某種沙門氏菌(如豬霍亂沙門氏菌）的毒力基因，尚未完全研究清楚。在過(guò) 去二十多年中，得到廣泛認(rèn)同的減毒沙門氏菌疫苗候選株為數(shù)不多，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株 (aroA、aroCD、purA)、壓力反應(yīng)缺陷株(htrA)、腺苷酸環(huán)化酶缺陷株(cya、crp)等。
[0004]造成有效的減毒菌株開發(fā)數(shù)量少并困擾研究人員的主要問(wèn)題之一是:在眾多已發(fā) 現(xiàn)或可能的毒力基因中，并未得到哪些毒力基因一定適用于某類或某種減毒菌株的構(gòu)建的 確切認(rèn)識(shí)。因而，對(duì)于具體某種細(xì)菌的減毒構(gòu)建而言，需要進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)確定相關(guān)的毒力因 子，并尋求適用于該菌株的減毒構(gòu)建方案。對(duì)于研究較少的細(xì)菌而言(如豬霍亂沙門氏菌）， 減毒菌株的研究工作更顯得十分困難。
[0005] 在減毒豬霍亂沙門氏菌載體構(gòu)建的研究領(lǐng)域中，有效的菌株主要為galE突變株、 aroA突變株、cya/crp突變株、以及其它基于slyA、hilA等基因而構(gòu)建的突變株。目前而言， 對(duì)于是否還可以采取其它方法對(duì)豬霍亂沙門氏菌進(jìn)行減毒構(gòu)建，尚未十分清楚。因此亟待 開發(fā)其它對(duì)豬霍亂沙門氏菌有效的減毒構(gòu)建方法，以深化對(duì)減毒菌株構(gòu)建乃至相關(guān)疫苗研 究的認(rèn)識(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的之一在于提供一株減毒豬霍亂沙門氏菌 S. Cholerasuis S1210，其特征在于，所述減毒豬霍亂沙門氏菌S. Cholerasuis S1210缺失 wbaD基因，分類命名為Salmonella choleraesuis S1210,保藏于武漢市武昌珞珈山的中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)）中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為:CCTCC Μ 2015632， 保藏時(shí)間為:2015年10月22日。
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)wbaD基因與豬霍亂沙門氏菌的毒力具有較 強(qiáng)關(guān)系，通過(guò)敲除其wbaD基因可以獲得減毒效果好的減毒菌株?？赡艿脑蛏性谘芯慨?dāng)中。
[0008] 需要指出的是，目前對(duì)于哪些是豬霍亂沙門氏菌的主要毒力基因尚未建立確切 的理論指導(dǎo)，在其它沙門氏菌或者其它需要進(jìn)行減毒設(shè)計(jì)的菌種中行之有效的減毒方案， 對(duì)于豬霍亂沙門氏菌而言并不奏效或效果較差。如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例所示，當(dāng)進(jìn)行wzy基 因、wbaB基因、wbaC基因、manB基因、manC基因缺失處理時(shí)，所得處理后的豬霍亂沙門氏菌菌 株要么不具備減毒效果、要么減毒效果不理想。
[0009] 如本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例所示，本發(fā)明所得菌株具有非常良好的減毒效果。
[0010] 本發(fā)明對(duì)本領(lǐng)域的貢獻(xiàn)之一在于，發(fā)現(xiàn)了wbaD基因與豬霍亂沙門氏菌毒力的關(guān) 系，并構(gòu)建了一株減毒效果優(yōu)秀的豬霍亂沙門氏菌。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供制備上述減毒豬霍亂沙門氏菌S.Cholerasuis S1210的方法，該方法包括如下步驟：
[0012] 1)對(duì)wbaD基因的上同源臂和下同源臂進(jìn)行擴(kuò)增；
[0013] 2)用豬霍亂沙門菌C3545基因組為模板，擴(kuò)增wbaD的下同源臂和下同源臂；
[0014] 3)融合片段構(gòu)建：以wbaD基因片段的上同源臂和下同源臂為模板，擴(kuò)增同源臂融 合片段；
[0015] 4)用Ahdl酶切質(zhì)粒PRE112,回收純化酶切產(chǎn)物，用連接試劑盒連接PRE112大片段 與同源臂融合片段，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒抽提后，得到質(zhì)粒PRE112-A wbaD;
[0016] 5)將質(zhì)粒pREl 12- Δ wbaD轉(zhuǎn)入c7232菌株感受態(tài)細(xì)胞，以含有質(zhì)粒pREl 12- Δ wbaD 的c7213菌株為供體菌，以C3545菌株作為受體菌，進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移，經(jīng)PCR鑒定后，得到減毒豬 霍亂沙門氏菌S.Cholerasuis S1210;
[0017] 所述wbaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0018] 所述wbaD基因片段的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0019] 所述wbaD基因片段的下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0020] 用于擴(kuò)增wbaD基因的上同源臂的引物為：
[0021 ] DwbaD-lF：CCGCTGATGGAAGTGCGAACG
[0022] DwbaD-lR：ggttaacttattttactttccggatgtaaac
[0023] 用于擴(kuò)增wbaD基因的下同源臂的引物為：
[0024] DwbaD~2F：gtaaaataagttaaccaagcgggaaaatatc
[0025] DwbaD-2R:GATTCAACAAACTCTTTCACCG。
[0026] 步驟1)中，對(duì)wbaD基因的上同源臂進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增片段大小為346bp;對(duì)wbaD基 因的下同源臂進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增片段大小為333bp。
[0027] 在步驟2)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)體系為：于50yL反應(yīng)體系中進(jìn)行，具體反應(yīng)體系 為模板DNA lyL，Takara高保真酶25yL，上、下游引物各lyL，ddH20 22yL;具體條件為：98°C 變性2min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為98°(：108,55°(：158,721€30 8，共循環(huán)30次;循環(huán)后72°(：延 伸10min。
[0028] 在步驟3)中進(jìn)行融合片段構(gòu)建時(shí)，PCR反應(yīng)體系為：于50yL反應(yīng)體系中：上下游同 源臂DNA各lyL，Takara高保真酶25yL，ΙΟμπιο 1/L上、下游引物各lyL，ddH20 22yL;具體條件 為:98°C變性5min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為98 °C 10s，55°C 15s，72°C 30s，共循環(huán)30次;循環(huán)后 72°C 延伸 10min。
[0029] 步驟5)所述結(jié)合轉(zhuǎn)移步驟為：用含DAP的液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)供體菌，用LB培養(yǎng)基培 養(yǎng)受體菌，至OD600為0.6左右，取供體菌500ul，受體菌300ul于含氯霉素抗性(25yg/mL)平板 一側(cè)混勻，平板斜放，正放培養(yǎng)24h，挑取菌苔，劃線，37°C靜止培養(yǎng)，直至得到單菌落，得到 的單菌落進(jìn)行蔗糖負(fù)篩。所述蔗糖負(fù)篩的步驟為:挑取單菌落加入無(wú) NaCl的LB液體培養(yǎng)基， 于37°C，70rpm下，搖菌2h，取100ul菌液10倍倍比稀釋1000倍后，再取100ul菌液涂含10%蔗 糖的LB平板。
[0030] 步驟5)所述PCR鑒定，步驟為：
[0031]對(duì)長(zhǎng)出單菌落的蔗糖平板，選擇一個(gè)區(qū)域進(jìn)行挑菌，每個(gè)菌落同時(shí)分別劃線于Cm 板LB板，挑菌時(shí)沾到即可不要挑到菌落下方菌；
[0032]鑒定并存菌，在于挑取10~20個(gè)Cm不生長(zhǎng)，LB生長(zhǎng)的菌落，得到的陽(yáng)性菌落再次劃 線LB板后，PCR鑒定，仍為陽(yáng)性者，為缺失株構(gòu)建成功；
[0033] PCR反應(yīng)體系：up水4.4ul、模板DNA 0.2ul、上同源臂上游引物0.2ul、下同源臂下 游引物〇.2ul、Pfu PCR Master(KP201)5ul;PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min、94°C變性30s、 55°C退火30s、72°C延伸lmin、72°C延伸lOmin、變性至延伸步驟重復(fù)30個(gè)循環(huán)。
[0034]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述減毒豬霍亂沙門氏菌S.Cholerasuis S1210在 疫苗上的應(yīng)用。
[0035]本發(fā)明的有益效果：
[0036]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了wbaD基因與豬霍亂沙門氏菌毒力之間的關(guān)系，所得菌株減毒效果 好，可用于疫苗的制備。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1為本發(fā)明減毒豬霍亂沙門氏菌S.Cholerasuis S1210的銀染結(jié)果圖，圖中泳道 1為野生菌，泳道6為本發(fā)明菌株。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 [0039] 1、引物設(shè)計(jì)(用于突變株的構(gòu)建與鑒定）
[0040] 參考豬霍亂沙門菌SC-67全基因組序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物分別用于缺失wbaD基因 (DwbaD-lF/DwbaD-lR，DwbaD-2F/DwbaD-2R)。從豬霍亂沙門菌C3545 中分別擴(kuò)增wbaD基因的 上下游片段:up-wbaD(上同源臂）和down-wbaD(下同源臂），擴(kuò)增片段大小分別為416bp和 511bp〇
[0041 ] DwbaD-lF：GACCATAGAGTCCAAAGTGA
[0042] DwbaD-lR：AAACGCGCTGTTACTTTTTTCCATATAAAA
[0043] DwbaD-2F：AAAAAAGTAACAGCGCGTTTATCAGTTTTG
[0044] DwbaD-2R：CATTTTAAAGCTGCCAAGGCT
[0045] 2、豬霍亂沙門菌C3545wbaD突變株的構(gòu)建
[0046] 用已提取的豬霍亂沙門菌C3545基因組為模板，分別用引物DwbaD-lF/DwbaD-lR， DwbaD_2F/DwbaD_2R擴(kuò)增wbaD基因的上下游同源臂。
[0047] PCR反應(yīng)體系為：50yL反應(yīng)體系中進(jìn)行，具體反應(yīng)體系為模板DNA lyL，25mmol/L MgCl2 0.5yL，buffer 10yL，10ymol/L 上、下游引物各lyL，2mmol/L dNTPs lyL，DNA polymerase 0.75yL，ddH2〇 34.75yL。具體條件為：98°C變性5min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為 94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，共循環(huán)30次。循環(huán)后72°C延伸10min。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1%的 瓊脂糖凝膠電泳分析后，由DNA純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
[0048] 3、重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建
[0049] 融合片段的構(gòu)建：