一種構(gòu)建中國小麥花葉病毒侵染性克隆的方法及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種重要作物病毒的全長cDNA侵染性克隆構(gòu)建方法及其應用領域，尤 其是一種構(gòu)建中國小麥花葉病毒侵染性克隆的方法及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] ±傳禾谷類作物病毒病在世界類廣泛發(fā)生且一直難W防控。在上世紀末，本實驗 室在我國山東首次發(fā)現(xiàn)了一種引起小麥花葉病的±傳病毒，分子鑒定顯示該±傳病毒是植 物病毒的一個新種，命名為中國小麥花葉病毒(化inese wheat mosaic virus,CWMV)。該病 毒新種現(xiàn)已劃入靑狀病毒科(family Virgaviridae)菌傳桿狀病毒屬（genus Furovirus)。 CWMV可由根部專性寄生的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)傳播且可在真菌介體的休眠抱 子中存活數(shù)載，因此，化學藥劑也難W將〔￥1￥從±壤中根除。CWMV在小麥病株上引起典型的 癥狀包括:幼葉呈現(xiàn)稱綠條紋，老葉則黃化甚至變成紫色。嚴重的病株矮縮、萎黨甚至死亡， 從而導致產(chǎn)量損失嚴重。
[0003] CWMV粒子呈棒狀，內(nèi)含2條單鏈正義RNA(ssRNA)基因組片段，即RNA1和RNA2。本實 驗室的基因組測序分析表明RNA1長7147nt，編碼3個病毒運動和復制所必需的蛋白；而RNA2 則較短，僅3564nt，編碼4個蛋白，其中3個與病毒外殼蛋白有關，另一個則是富含半脫氨酸 的RNA沉默抑制子。病毒全長cDNA克隆是為深入理解病毒生物學特性的重要技術(shù)手段，CWMV 侵染性克隆的缺乏不僅嚴重阻礙了人們對CWMV侵染、復制、組裝、致病機制的理解，而且也 限制了實驗室小麥抗性的鑒定。自從本實驗室測定了CWMV的基因組全序列后，一直嘗試構(gòu) 建其全長cDNA侵染性克隆，但均未成功。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種簡單快速的構(gòu)建中國小麥花葉病毒 侵染性克隆的方法及其應用。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案:一種構(gòu)建中國小麥花葉病毒侵染性克隆 的方法，具體包括W下步驟：
[0006] 1)引物設計:基于本實驗室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列 共設計4條引物，引物序列見表1，其中引物對P1F/P1R用于擴增RNA1，引物對P2F/P2R用于擴 增RNA2;
[0007] 2)病毒基因組總RNA提?。喝『? 0 -10 0μ 1 CWMV粒子的提取液，利用Tr i Z 01試劑 (Invitrogen)按照試劑說明書提取病毒基因組總RNA;
[000引 3)擴增反應：W提取的病毒基因組RNA作逆轉(zhuǎn)錄模板，采用高保真的扣usio郵DNA 聚合酶(肥B)進行擴增，其中引物對P1F/P1R擴增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-化，引物對口2。作2巧廣 增的RNA2產(chǎn)物長約3.6-化；
[0009] 4)病毒cDNA克隆:擴增RNA1和RNA2產(chǎn)物分別用BamHI/SacI、HindI/EcoRI進行雙酶 切反應，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別連接至經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測 序驗證獲得分別含RNAl和RNA2全長cDNA片段的重組質(zhì)粒PT7-R1、pT7-R2;
[0010] -種構(gòu)建中國小麥花葉病毒侵染性克隆的方法的應用，具體步驟包括：
[0011] 1)體外轉(zhuǎn)錄:重組質(zhì)粒PT7-R1、pT7-R2分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Spel單酶切，獲得線性 化的重組質(zhì)粒載體并用于體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄反應采用Ambion mMessage mMachine試劑盒 (Invitrogen)參照產(chǎn)品說明書步驟進行；
[0012] 2)摩擦接種：然后取RNA1和RNA2體外轉(zhuǎn)錄各扣g混合，溶解于1ml含50mM甘氨酸 (glycine)、50Mm憐酸氨二鐘化抽Κ)4)、pH 9.2的緩沖液，然后取少許石英砂摩擦接種植物；
[0013] 3)侵染活性分析:二周后進行病毒分子檢測并記錄植株表型變化。
[0014] 表1用于構(gòu)建克隆的引物
[0015]
[0016] 發(fā)明有益的效果是:本發(fā)明針對當前中國小麥花葉病毒研究技術(shù)的難點，發(fā)展建 立了一種簡單快速構(gòu)建其全長cDNA克隆的方法，并成功獲得了具有侵染活性的全長cDNA克 隆，運不僅有助于相關病毒的基因功能、反向遺傳學的研究，而且有利于小麥抗性的篩選 等。
【附圖說明】
[0017] 圖1: CWMV全長cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄物侵染性活性分析，其中葉片1來自于摩擦接種 CWMV全長cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄物的小麥植株;葉片2來自于接種野生型CWMV的小麥植株;葉片 3來自于模擬接種(mock-inoculate)的小麥植株；
[0018] 圖2:No;rthe;rn blotting分析CWMV全長cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄物在小麥體內(nèi)的復制活 性，其中樣品1為模擬接種(mock-inoculate)的健康小麥;樣品2為接種野生型CWMV的病株 小麥;樣品3為摩擦接種CWMV全長cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄物的小麥植株；
[0019] 圖3:應用電子顯微鏡觀察分析CWMV全長cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄物在小麥體內(nèi)形成的 病毒粒子，其中比例尺表示50nm。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：
[0021] 實施例:一種簡單快速的構(gòu)建中國小麥花葉病毒侵染性克隆的方法及其對小麥的 侵染活性分析，具體步驟：
[0022] 引物設計:通過本實驗室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列共 設計4條引物，引物序列見表1，其中引物對P1F/P1R用于擴增RNA1，引物對P2F/P2R用于擴增 RNA2；
[002引病毒基因組總RNA提?。喝『?0-100μ1 CWMV粒子的提取液，利用Trizol試劑 (Invitrogen)按照試劑說明書提取病毒基因組總RNA，即將病毒提取液轉(zhuǎn)入1.5ml新離屯、 管，加入1ml Trizol試劑（Invitrogen)，振蕩混勻后加入ο . 2ml氯仿，混勻后靜置3-5min， 12000g離屯、lOmin，取上清至新離屯、管并加入等體積異丙醇，混勻后12000g、4°C條件下離屯、 lOmin，棄上清，沉淀用70 %乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶解于無 R化se的dd此0中，提取的病 毒基因組RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后保存于-80°C備用；
[0024] 擴增反應：W提取的病毒基因組RNA作逆轉(zhuǎn)錄模板，采用高保真的Phusiot#DNA聚 合酶(肥B)進行擴增，其中引物對P1F/P1R擴增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-化，引物對P2F/P2R擴增 的RNA2產(chǎn)物長約3.6-化，CWMV RNA1和RNA2的擴增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和切膠純化 后保存?zhèn)溆茫?br>[00巧]病毒cDNA克隆:擴增RNA1和RNA2產(chǎn)物分別用BamHI/SacI、HindI/EcoRI進行雙酶切 反應，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別連接至經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序 驗證獲得分別含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組質(zhì)粒PT7-R1、pT7-R2;
[0026] 體外轉(zhuǎn)錄:重組質(zhì)粒pT7-Rl、pT7-R2分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Spel單酶切，獲得線性化 的重組質(zhì)粒載體并用于體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄反應采用Ambion mMessage mMachine試劑盒 (Invitrogen)參照產(chǎn)品說明書步驟進行；
[0027] 摩擦接種：取RNA1和RNA2體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物各扣g，混合并溶解于1ml含50mM甘氨酸 (glycine)、50mM憐酸氨二鐘化抽Κ)4)、抑9.2的緩沖液，然后取少許石英砂摩擦接種植物， 二周后進行病毒分子檢測并記錄植株表型變化。
[0028] 結(jié)果分析:在接種體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后，小麥植株的系統(tǒng)葉片上明顯呈現(xiàn)稱綠花葉癥 狀（圖1)，運與野生型病毒引起的癥狀相似，而與模擬接種的對照小麥葉片明顯不同，表明 本發(fā)明構(gòu)建的CWMV全長cDNA具有侵染活性且能在植物體內(nèi)系統(tǒng)運動;Northern Blotting 檢測顯示本發(fā)明構(gòu)建的CWMV全長cDNA侵染性克隆能夠在小麥植株中高效地復制，且能夠產(chǎn) 生大量的亞基因組RNA(subgenomic RNA，sgRNA)(圖2);應用電子顯微鏡觀察顯示，在接種 CWMV全長cDNA克隆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的小麥病汁液中可發(fā)現(xiàn)大量的病毒粒子（圖3 )，表明本發(fā)明構(gòu) 建的CWMV全長cDNA侵染性克隆能夠在小麥植株中正確地組裝形成病毒粒子，和野生型病毒 一樣在小麥體內(nèi)完成其生命循環(huán)；另一方面接種CWMV全長cDNA克隆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的煙農(nóng)22( - 個小麥品種名稱)能夠發(fā)展形成典型的花葉癥狀，也表明該小麥品種是一個感病品種，對中 國小麥花葉病毒缺乏抗性。因此，本發(fā)明不僅針對當前中國小麥花葉病毒研究技術(shù)的難點， 發(fā)展建立了一種簡單快速構(gòu)建其全長cDNA克隆的方法，成功獲得了具有侵染活性的全長 cDNA克?。欢矣幸嬗陂_展小麥花葉病抗性品種的篩選已及相關病毒的反向遺傳學研究等 工作。
[0029] 除上述實施例外，本發(fā)明還可W有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種構(gòu)建中國小麥花葉病毒侵染性克隆的方法，包括以下步驟： 1) 引物設計:基于本實驗室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列共設 計4條引物，其中引物對P1F/P1R用于擴增RNA1，引物對P2F/P2R用于擴增RNA2; 2) 病毒基因組總RNA提取:取含50-100μ1中國小麥花葉病毒粒子的提取液，利用Trizol 試劑按照試劑說明書提取病毒基因組總RNA; 3) 擴增反應：以提取的病毒基因組RNA作逆轉(zhuǎn)錄模板，采用高保真的Phusion DNA聚合 酶進行擴增，其中引物對P1F/P1R擴增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-kb，引物對P2F/P2R擴增的RNA2 產(chǎn)物長約3.6-kb; 4) 病毒cDNA克隆:擴增RNA1和RNA2產(chǎn)物分別用BamHI/SacI、HindI/EcoRI進行雙酶切反 應，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別連接至經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序驗 證獲得分別含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組質(zhì)粒pT7-Rl、pT7-R2。2. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建中國小麥花葉病毒侵染性克隆的方法的應用，包括 以下步驟： 1) 體外轉(zhuǎn)錄:重組質(zhì)粒pT7-Rl、pT7-R2分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Spel單酶切，獲得線性化的 重組質(zhì)粒載體并用于體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄反應采用Ambion mMessage mMachine試劑盒參照 產(chǎn)品說明書步驟進行； 2) 摩擦接種:取RNA1和RNA2體外轉(zhuǎn)錄各5yg混合，溶解于lml含50mM甘氨酸、50Mm磷酸氫 二鉀、pH 9.2的緩沖液，然后取少許石英砂摩擦接種植物； 3) 侵染活性分析:二周后進行病毒分子檢測并記錄植株表型變化。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種簡單快速構(gòu)建中國小麥花葉病毒全長cDNA侵染性克隆的方法，應用一套病毒基因組特異性引物以純化的病毒基因組RNA為模板進行一步法RT-PCR擴增，該套引物共有4條，分別為P1F、P1R、P2F、P2R，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至載體，生物學活性分析顯示本方法所獲得的CWMV全長cDNA克隆能成功地侵染小麥等植物并可在植物體內(nèi)復制、系統(tǒng)運動和裝配，表明該克隆具有侵染活性，可用于相關病毒功能基因組研究和植物抗病性分析。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/66
【公開號】CN105543271
【申請?zhí)枴緾N201610002962
【發(fā)明人】張恒木, 羊健, 張芬, 李靜, 陳劍平
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學院
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月4日