一種快速鑒定產(chǎn)氨基甲酸乙酯酵母的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速鑒定產(chǎn)氨基甲酸乙酯酵母的方法，屬于生物技術(shù)及食品安全 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡(jiǎn)稱EC)是一種潛在的多位點(diǎn)致癌物，廣泛存在 于多種發(fā)酵食品和酒精飲料中，如面包、白酒、醬油等。形成EC的前體物質(zhì)主要有瓜氨酸、尿 素、氰化物以及氨甲酰磷酸，他們能自發(fā)與乙醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成EC。其中，尿素是形成EC 的最重要的前體物質(zhì)。在發(fā)酵過程中，尿素主要是是由酵母代謝精氨酸所產(chǎn)生。在酵母的精 氨酸代謝途徑中，carl編碼精氨酸酶，是該途徑中的第一個(gè)酶，參與精氨酸的分解代謝形成 尿素。
[0003] 在酵母中，編碼精氨酸酶的carl呈現(xiàn)出多樣性，而目前大量的報(bào)道集中于釀酒酵 母。傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中由多種酵母共同參與，如pichia，Candida，Saccharomyces等。目前 所報(bào)道的carl序列不多，由已知的公開的carl序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在不同酵母種屬中序列差異 很大，以至于目前還沒有一種引物能同時(shí)檢測(cè)不同酵母的carl基因。
[0004] 我國(guó)發(fā)酵食品種類繁多，而我國(guó)對(duì)發(fā)酵食品中EC的研究主要集中在檢測(cè)方面。當(dāng) 前迫切需要跟蹤我國(guó)各類發(fā)酵食品的發(fā)酵過程，對(duì)EC的形成機(jī)制作深入研究。為了深入了 解發(fā)酵食品發(fā)中能產(chǎn)EC的酵母，有必要建立起一種快速鑒定產(chǎn)EC酵母的方法，為之后進(jìn)一 步用微生物手段控制發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯形成提供了思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)氨基甲酸乙酯酵母快速檢測(cè)的引物 及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種可快速檢測(cè)酵母是否具有產(chǎn)氨基甲酸乙酯潛力 或者可快速對(duì)酵母種屬進(jìn)行分類的引物對(duì)，所述引物對(duì)：
[0007] (1)由核苷酸序列為NCCNCCNBBNACNSKNGTNCCNGTNG(如SEQ ID N0.1 所示）和核苷 酸序列為TGGWTNGAYGCNCAYGCNGAYATHAA(如SEQ ID N0.2所示）的核苷酸片段組成;或者是
[0008] (2)由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2的序列同時(shí)進(jìn)行反向互補(bǔ)后得到的兩個(gè)核苷酸 片段組成。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述引物對(duì)在檢測(cè)樣品中是否存在具有產(chǎn)氨基甲酸 乙酯潛力的酵母的應(yīng)用。
[0010]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述樣品是來自任意含有酵母的發(fā)酵食品體系的樣 品，或者是從發(fā)酵食品體系中篩選得到的酵母的菌落、發(fā)酵液、菌體，或者是含有酵母基因 組的樣品。
[0011]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵食品體系所指的發(fā)酵食品是白酒、黃酒、食 醋、泡菜、醬油、酸奶、干酪、酒釀、豆豉、乳腐、黃酒、啤酒、葡萄酒中的任意一種。優(yōu)選的發(fā)酵 食品體系為白酒發(fā)酵體系、黃酒發(fā)酵體系或食醋發(fā)酵體系。
[0012]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酵母是以下任意一種或者多種：Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae，Hanseniaspora osmophila，Issatchenkia oriental is，Kazachstania exigua，Pichia anomala，Pichia membranifaciens， Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis f ibuligera、Schizosaccharomyces pombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Steri gmatomyces e1viae、 Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae^Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、 Brettanomyces custersianus^Debaryomyces hansenii或者Candida apicola〇 [0013]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酵母，來自白酒發(fā)酵體系，包括Saccharomyces cerevi siae(來自清香型或芝麻香型白酒）、Pichia farinosa(清香型白酒）、 Saccharomycopsis fib uligera(清香型白酒）、Clavispora lusitaniae(清香型白酒）、 Issatchenkia orientalis(清香型或芝麻香型白酒）、Pichia membranifaciens(清香型或 醬香型白酒）、Pichia anomala(芝麻香型白酒）、Hanseniaspora osmophila(清香型白酒）、 Schizosaccharomyces pombe(濃香型白酒）。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述具有產(chǎn)氨基甲酸乙酯潛力的酵母是指含有精氨 酸酶編碼基因的酵母。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述檢測(cè)是指利用引物對(duì)進(jìn)行PCR，如果PCR產(chǎn)物檢 狽L顯示具有250-500bp之間（具體是在330bp左右）的片段，則代表該酵母具有carl基因，即 該酵母具有產(chǎn)生氨基甲酸乙酯的潛能。PCR產(chǎn)物如果不在250-500bp之間（具體是330bp左 右)或者沒有條帶，則代表該酵母不具有carl基因，也就不具備產(chǎn)氨基甲酸乙酯的潛能。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PCR是先提取樣品的基因組再進(jìn)行PCR或者直接 對(duì)酵母菌液進(jìn)行PCR;
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增使用25微升反應(yīng)體系:所述反應(yīng)體系為 2XTaq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升，兩種簡(jiǎn)并引物各0.5微升，酵母DNA 模板1微升，加水至總體積25微升;PCR擴(kuò)增的條件為:94°C4分鐘，94°C1分鐘，50°C30秒，72 °C1分鐘，72°C10分鐘(40個(gè)循環(huán)）；
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種快速檢測(cè)酵母種屬的方法，所述方法是使用所述 的SEQ ID N0.1和SEQ ID勵(lì).2的引物對(duì)對(duì)含有酵母基因組的樣品進(jìn)行?0?，將得到的？0?產(chǎn) 物的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，從而得知酵母的屬種。
[0019] 所述酵母是以下任意一種或者多種:Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae， Hanseniaspora osmophila，Issatchenkia orientalis，Kazachstania exigua，Pichia anomala，Pichia membranifaciens，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis f ibul igera或者Schizosaccharomyces pombe、Schizosaccharomyces pombe、Pi chia fermentans、Trichosporon asahi i > Sterigmatomyces elviae、Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、 Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、Cryptococcus neof ormans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。
[0020] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物對(duì)或SEQID NO. 1/SEQ ID NO.2同時(shí)反向互補(bǔ)得到的引物對(duì)在宏基因組方面的應(yīng)用。所述應(yīng)用，是用所 述引物對(duì)進(jìn)行含有宏基因組的樣品的PCR，通過PCR結(jié)果判定樣品中是否含有具有產(chǎn)氨基甲 酸乙酯潛力的酵母(如果PCR產(chǎn)物檢測(cè)，顯示具有330bp左右的片段，則代表該宏基因組中有 carl的存在，即該環(huán)境樣品中存在產(chǎn)氨基甲酸乙酯酵母的存在；PCR產(chǎn)物如果不在250-500bp(具體是在330bp左右）范圍或者沒有條帶，該宏基因組中沒有carl的存在，即該環(huán)境 樣品中不存在產(chǎn)氨基甲酸乙酯酵母），和/或根據(jù)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果判定酵母的屬種。
[0021] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物對(duì)或SEQID NO. 1/SEQ ID N0.2同時(shí)反向互補(bǔ)得到的引物對(duì)在DGGE分析微生物方面的應(yīng)用。所述應(yīng)用， 是用所述引物對(duì)進(jìn)行含有微生物基因組的樣品的PCR，通過PCR結(jié)果判定樣品中是否含有具 有產(chǎn)氨基甲酸乙酯潛力的酵母，和/或根據(jù)PCR產(chǎn)物的測(cè)序序列在在NCBI上的比對(duì)結(jié)果判定 酵母的屬種。
[0022] 本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種獲得不同種屬的酵母的精氨酸酶基因序列的方 法，是使用所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物對(duì)或SEQIDN0.1/SEQIDN0.2同時(shí)反 向互補(bǔ)得到的引物對(duì)對(duì)酵母基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(或者進(jìn)一步根 據(jù)PCR測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的上下游序列進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而得到全長(zhǎng)的精氨酸酶基 因序列），即得到精氨酸酶基因序列。
[0023] 在本發(fā)明中，使用SEQ ID N0.1/SEQ ID勵(lì).2的引物對(duì)樣品進(jìn)行?0?時(shí)，引物對(duì)的 各引物的濃度為lOngAU-lOOOngAU。
[0024]在本發(fā)明中，使用SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2的引物對(duì)（或SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO.2同時(shí)反向互補(bǔ)得到的引物對(duì))樣品進(jìn)行PCR時(shí)，PCR擴(kuò)增使用25微升反應(yīng)體系:所述反應(yīng) 體系為2XTaq PCRMasterMix(with loading dye)12.5微升，兩種簡(jiǎn)并引物各0.5微升，酵 母DNA模板1微升，加水至總體積25微升;PCR擴(kuò)增的條件為:94°C4分鐘，94°C 1分鐘，50°C30 秒，72°C 1分鐘，72°C 10分