一種無標(biāo)簽單鏈型人源雙特異性抗體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種單鏈型人源雙特異性抗體 及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] B細(xì)胞惡性腫瘤是一類B淋巴細(xì)胞相關(guān)的惡性腫瘤，包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、 Burkitt淋巴瘤、B淋巴細(xì)胞白血病等，發(fā)病率較高，嚴(yán)重危害人類健康。B細(xì)胞惡性腫瘤細(xì) 胞表面表達(dá)較高的CD分子，如CD19、CD20和CD22等，可以作為抗體藥物的治療靶點。針 對這些CD分子的抗體藥物能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前，針對 ⑶19分子開發(fā)的抗體藥物美羅華（Rituximab)已經(jīng)被批準(zhǔn)上市，用于治療B細(xì)胞淋巴瘤。
[0003] T淋巴細(xì)胞是殺傷腫瘤的重要免疫細(xì)胞，其表面有CD3、白介素-2受體等分子。研 究表明，CD3抗體和白介素-2配體可以有效激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)其活化和增殖，從而提高 其殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，這些作用也已經(jīng)被應(yīng)用于腫瘤的免疫療法。然而由于缺乏針對腫 瘤細(xì)胞的特異靶向性，因此這些T淋巴細(xì)胞對腫瘤殺傷的效能不足。如果把能夠激活T淋 巴細(xì)胞的CD3抗體與靶向B細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞的CD19抗體融合制備成CD3-CD19雙特異性 抗體，則能夠有效地在腫瘤細(xì)胞周圍富集和活化T淋巴細(xì)胞，賦予T淋巴細(xì)胞特異靶向性， 從而顯著提高T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。
[0004] 作為一種腫瘤免疫療法，T細(xì)胞治療近年來發(fā)展迅速，受到很大關(guān)注。傳統(tǒng)的T細(xì) 胞治療如LAKXIK等，借助細(xì)胞因子在體外使目標(biāo)T細(xì)胞大量擴增，然后輸入腫瘤患者體內(nèi) 發(fā)揮抗腫瘤作用。這種療法的顯著不足是缺乏針對腫瘤細(xì)胞的特異靶向性，因此所需要的 T細(xì)胞數(shù)量很大，不利于生產(chǎn)。CAR-T是另一種T細(xì)胞治療方法，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使T細(xì)胞 獲得腫瘤靶向性。然而，轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作相對復(fù)雜，質(zhì)量控制難度較大，而且倫理上還有待 TG 口 〇
[0005] 人體內(nèi)的天然抗體是由重鏈和輕鏈組成，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)對于 抗原的結(jié)合特別重要。由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的融合蛋白（即單鏈抗體）仍然具 有良好的抗原結(jié)合活性。由兩個不同單鏈抗體融合而成的單鏈型雙特異性抗體的體積較 小，親和力適中，具有較好的組織滲透能力。然而，單鏈抗體缺乏抗體恒定區(qū)，難以檢測，因 此常規(guī)在單鏈抗體末端加入標(biāo)簽蛋白（如6個組氨酸標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、生物素標(biāo)簽等），以 達(dá)到檢測和純化的目的。然而，當(dāng)帶有標(biāo)簽蛋白的單鏈抗體用于人體治療時，很有可能產(chǎn)生 抗標(biāo)簽蛋白抗體，從而影響藥效，這在一定程度上限制了單鏈抗體作為藥物的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是現(xiàn)有單鏈抗體末端需要加入標(biāo)簽蛋白，從而可能 在使用時產(chǎn)生抗標(biāo)簽蛋白抗體，藥效不佳的問題。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是 提供了一種單鏈型雙特異性抗體。該其單鏈型雙特異性抗體是由抗人CD3的單鏈抗體和抗 人CD19的單鏈抗體直接連接得到或者通過連接肽連接得到，且不含標(biāo)簽蛋白。
[0007] 其中，上述的單鏈型雙特異性抗體中的抗人CD3的單鏈抗體的為：
[0008] a)、氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO. 2所示的單鏈抗體；
[0009] 或者：
[0010] b)氨基酸序列為在SEQ ID NO. 2所示序列的基礎(chǔ)上取代和/或缺失和/或添加一 個或幾個氨基酸獲得的與a)中所述的單鏈抗體的功能相同或相似的抗體。
[0011] 其中，上述的單鏈型雙特異性抗體中的抗人CD19所述的抗人CD19的單鏈抗體 為：
[0012] a)、氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO. 4所示的單鏈抗體；
[0013] 或者：
[0014] b)氨基酸序列為在SEQ ID NO. 4所示序列的基礎(chǔ)上取代和/或缺失和/或添加一 個或幾個氨基酸獲得的與a)中所述的單鏈抗體的功能相同或相似的抗體。
[0015] 優(yōu)選的，上述的單鏈型雙特異性抗體為：
[0016] a)、氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO. 6所示的抗體；
[0017] 或者：
[0018] b)氨基酸序列為在SEQ ID NO. 6所示序列的基礎(chǔ)上取代和/或缺失和/或添加一 個或幾個氨基酸獲得的與a)中所述的抗體的功能相同或相似的抗體。
[0019] 進(jìn)一步的，上述的單鏈型雙特異性抗體的氮端還連接有信號肽。
[0020] 此外，本發(fā)明還提供了編碼上述單鏈型雙特異性抗體的編碼基因。
[0021] 進(jìn)一步的，上述的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 5;或者其核苷酸序列為 SEQ ID NO. 5的簡并序列。
[0022] 本發(fā)明還提供了含有上述編碼基因的重組載體。所述的重組載體可為質(zhì)粒載體或 者病毒載體。
[0023] 本發(fā)明還提供了含有上述重組載體的宿主細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞可以為原核細(xì)胞 或者真核細(xì)胞。
[0024] 同時，本發(fā)明還提供了上述單鏈型雙特異性抗體在制備預(yù)防或者治療B細(xì)胞惡性 腫瘤的藥物中的用途。
[0025] 其中，所述的B細(xì)胞惡性腫瘤為：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、急性B淋 巴細(xì)胞白血病等B細(xì)胞惡性腫瘤。
[0026] 本發(fā)明的單鏈型雙特異性抗體是由來自抗CD3抗體的可變區(qū)與抗CD19抗體的可 變區(qū)構(gòu)成，之間由一條連接肽（Linker)相連。特別的是，該雙特異性抗體不帶有標(biāo)簽蛋白。
[0027] 上述單鏈型雙特異性抗體中的抗⑶3抗體單鏈抗體由抗⑶3抗體的重鏈可變區(qū) (VH)和輕鏈可變區(qū)（VL)融合而成，可表示為CD3scFv。進(jìn)一步的，重鏈和輕鏈可變區(qū)間由 連接肽連接。常用的連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 7)，可表示為 (G4S) 3。優(yōu)選的，上述治療B細(xì)胞惡性腫瘤的雙特異性抗體中的CD3抗體可變區(qū)的核苷酸 序列為SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0028] 上述單鏈型雙特異性抗體中的抗D19單鏈抗體是重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)融合而成，可表示為⑶19scFv。進(jìn)一步的，重鏈和輕鏈可變區(qū)間由連接肽連接。常用 的連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS，可表示為（G4S)3。優(yōu)選的，上述治療B細(xì)胞惡 性腫瘤的雙特異性抗體中的CD19抗體可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示，其編碼的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0029] 上述雙特異性抗體的兩個scFv結(jié)構(gòu)之間可以使用鏈接肽連接接，其目的在于提 供一定的柔韌性，以避免⑶3scFv和⑶19scFv形成結(jié)構(gòu)上的空間位阻。連接肽氨基酸序列 和長度均可以有一定的變化，也可以有很多本領(lǐng)域常用的鏈接肽供選擇。比如，最常用的連 接肽的氨基酸序列為GGGGS (SEQ ID NO. 8)。
[0030] 進(jìn)一步的，上述治療B細(xì)胞惡性腫瘤的雙特異性抗體由⑶3scFv和⑶19scFv通過 連接肽融合而成，可表示為⑶3scFv-⑶19scFv。優(yōu)選的，上述治療B細(xì)胞惡性腫瘤的雙特異 性抗體的核苷酸序列為SEQ ID NO. 5所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0031] 本發(fā)明還提供了含有上述編碼治療B細(xì)胞惡性腫瘤的雙特異性抗體核苷酸序列 的基因載體。該載體可選自質(zhì)粒、病毒、DNA或RNA片段。
[0032] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種無標(biāo)簽的單鏈型人源⑶3-⑶19雙特 異性抗體，相應(yīng)的還提供了其檢測方法。本發(fā)明的雙特異性抗體可以穩(wěn)定地與T淋巴細(xì)胞 和B細(xì)胞惡性腫瘤結(jié)合，這使得該雙特異性抗體不僅可用于傳統(tǒng)的藥物療法，還可以在體 外重塑T淋巴細(xì)胞，以細(xì)胞治療的方式在極低效靶比情況下殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，本發(fā)明的 雙特異性抗體具有更佳的人體適用性和更廣泛的用途。
【附圖說明】
[0033] 圖L重組載體雙酶切鑒定。
[0034] 圖2.免疫印跡檢測宿主細(xì)胞表達(dá)分泌雙特異性抗體。
[0035] 圖3.聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測雙特異性抗體的純化。
[0036] 圖4.流式細(xì)胞術(shù)顯示本發(fā)明雙特異性抗體可以特異結(jié)合相應(yīng)的靶細(xì)胞。A :K562 ; B :Jurkat ;C :SU-DHL-6。
[0037] 圖5.免疫熒光顯示本發(fā)明雙特異性抗體可以特異結(jié)合相應(yīng)的靶細(xì)胞。A :K562 ;B : T淋巴細(xì)胞；C :Ramos。
[0038] 圖6. ELISA檢測本發(fā)明雙特異性抗體與靶細(xì)胞結(jié)合的時間效應(yīng)。A :Jurkat ;B : Raji0
[0039] 圖7.本發(fā)明雙特異性抗體介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞與Pfeiffer細(xì)胞的橋接作用。A :雙 特異性抗體；B :0KT3。
[0040] 圖8.本發(fā)明雙特異性抗體可以激活人外周血T