千道爾頓的硫醇反應性聚乙二醇。使用硫醇反應性聚乙二醇，實現(xiàn)人工轉錄因子的位點特 異性聚乙二醇化。本發(fā)明的人工轉錄因子中的唯一必不可少的含硫醇基氨基酸是位于鋅指 模塊中的鋅配位所必需的半胱氨酸殘基。這些硫醇基由于其鋅配位，對于聚乙二醇化是不 可利用的，因此，將一個或幾個半胱氨酸殘基納入到本發(fā)明的人工轉錄因子中為使用硫醇 特異性聚乙二醇試劑的聚乙二醇化提供游離的硫醇基。
[0053] 藥物組合物
[0054] 本發(fā)明還涉及包含如上定義的人工轉錄因子的藥物組合物?？紤]的藥物組合物是 向溫血動物尤其是人類腸胃外全身施用的組合物，尤其是靜脈內(nèi)施用的組合物，吸入的組 合物，和局部施用的組合物，尤其是眼局部使用，例如作為滴眼劑，或玻璃體內(nèi)、結膜下、目艮 球側（parabulbar)或眼球后施用。尤其優(yōu)選的是滴眼劑和玻璃體內(nèi)、結膜下、眼球側或眼 球后施用的組合物。組合物包含單獨的活性組分，或者優(yōu)選與藥學上可接受的載體一同的 活性組分。進一步考慮的是緩釋制劑?；钚越M分的劑量依賴于待治療的疾病并依賴于物種、 它的年齡、體重和個體狀況、個體藥代動力學數(shù)據(jù)以及施用方式。
[0055] 進一步考慮的是用于口腔遞送的藥物組合物，尤其是包含被合適地封裝（或者以 另外的方式防止其被消化道降解）的活性組分的組合物。例如，此類藥物組合物可以包含 膜透性增強劑、蛋白酶抑制劑，并且由腸溶包衣包封。
[0056] 藥物組合物包含大約1%至大約95%的活性成分。單位劑量形式例如是安瓿、藥 瓶、吸入器、滴眼劑等。
[0057] 本發(fā)明的藥物組合物以本身已知的方式制備，例如通過常規(guī)混合、溶解或冷凍干 燥方法。
[0058] 優(yōu)選使用活性組分的溶液、以及懸浮液或分散液，尤其是等滲水溶液、分散液或懸 浮液，其例如在含有單獨的活性組分或者與載體例如甘露醇一同的活性組分的冷凍干燥的 組合物的情況下，可以在使用前配制。藥物組合物可以進行滅菌和/或可以包含賦形劑，例 如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和/或乳化劑、增溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類和/或緩沖液，并 且以本身已知的方式制備，例如通過常規(guī)溶解和冷凍干燥方法。所述溶液或懸浮液可以包 含增粘劑，典型地為羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯酮或明膠、或還有 增溶劑，例如Tween80?(聚氧乙烯（20)脫水山梨醇單油酸酯）。
[0059]油中懸浮液包含習慣用于注射目的的植物油、合成油或半合成油作為油組分。關 于這一點，可以特別提及液體脂肪酸酯，其包含具有8-22個、尤其12-22個碳原子的長鏈脂 肪酸作為酸組分。這些脂肪酸酯的醇組分具有最多6個碳原子，并且是一價醇或多價醇，例 如一價、二價或三價醇，尤其是乙二醇和丙三醇。作為脂肪酸酯的混合物，植物油諸如棉子 油、杏仁油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油尤其有用。
[0060] 可注射制劑的制造通常在無菌條件下進行，其例如裝入安瓿或藥瓶和容器的密 封。
[0061] 對于腸胃外施用，以水可溶性形式的活性組分的水溶液，例如水可溶性鹽的水溶 液，或者含有增粘物質(zhì)例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖（并且如需要的話含有穩(wěn) 定劑）的含水注射懸浮液，是尤其合適的?；钚越M分任選與賦形劑一同還可以以冷凍干燥 劑的形式，并且可以在腸胃外施用前通過加入合適的溶劑配制入溶液中。
[0062] 用于吸入的組合物可以以氣溶膠形式如噴霧劑、霧或以滴劑的形式施用。氣溶膠 由溶液或懸浮液制備，其可以用劑量測定的吸入器或霧化器（即使用合適的推進劑例如二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適氣體向呼吸道或肺遞送特定 量的藥劑的裝置）以由患者吸入的氣溶膠化的藥物的短爆發(fā)（shortburst)的形式來遞 送。還可以提供具有合適粉末基質(zhì)（base)諸如乳糖或淀粉的用于吸入的粉末噴劑。
[0063] 滴眼劑優(yōu)選是含有合適的試劑以使組合物與淚液等滲（295-305m0sm/l)的活性 組分的等滲水溶液?？紤]的試劑是NaCl、檸檬酸、甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙二醇、葡 萄糖等。此外，組合物包含緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖劑或Tris緩 沖劑（三（羥甲基）氨基甲烷），以保持5-8的pH，優(yōu)選7. 0-7.4。組合物還可以含有抗菌 性防腐劑，例如對羥基苯甲酸酯類、季銨鹽類、諸如苯扎氯銨、聚六亞甲基雙胍（PHMB)等。 滴眼劑還可以含有黃原膠以產(chǎn)生凝膠樣滴眼劑，和/或其他增粘劑，諸如透明質(zhì)酸、甲基纖 維素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。
[0064] 人工轉錄閔子在治療方法中的用涂
[0065] 此外，本發(fā)明涉及如上所述的針對0PA1啟動子的人工轉錄因子，其用于增加0PA1 生產(chǎn)，和用于治療受0PA1影響的疾病，尤其是用于治療這樣的眼病。由0PA1調(diào)制的疾病是 常染色體顯性遺傳性視神經(jīng)萎縮、常染色體顯性視神經(jīng)萎縮加以及正常眼壓性青光眼。
[0066] 同樣，本發(fā)明涉及治療受0PA1影響的疾病的方法，其包括對需要其的患者施用治 療有效量的本發(fā)明的人工轉錄因子。特別地，本發(fā)明涉及治療與正常眼壓性青光眼或顯性 視神經(jīng)萎縮相關的神經(jīng)變性的方法。本發(fā)明的人工轉錄因子的有效量取決于待治療的疾病 的具體類型以及種族、其年齡、體重和個體狀況、個體藥動學數(shù)據(jù)和施用方式。對于向眼中 施用，優(yōu)選〇. 5-lmg的每月玻璃體注射。對于全身應用，優(yōu)選10mg/kg的每月注射。此外， 還優(yōu)選將緩釋儲庫制劑植入眼的玻璃體中。
[0067]人工轉錄_子在動物中的用涂
[0068] 此外，本發(fā)明涉及靶向動物0PA1啟動子以提高基因產(chǎn)物產(chǎn)生的人工轉錄因子的 用途。優(yōu)選地，將人工轉錄因子以用于向動物局部施用的合適組合物直接施用。 實施例
[0069]DNA質(zhì)粒的克降
[0070] 對于所有克隆步驟，限制性內(nèi)切核酸酶和T4DNA連接酶均購自NewEngland Biolabs。4下喊性磷酸酶（SAP)來自Promega。將高保真PlatinumPfxDNA聚合 酶（Invitrogen)用于所有標準PCR反應中。DNA片段和質(zhì)粒按照制造商說明書使用 NucleoSpinGel和PCRClean-up試劑盒、NucleoSpinPlasmid試劑盒或NucleoBondXtra MidiPlus試劑盒（Macherey-Nagel)來分離。寡核苷酸購自Sigma-Aldrich。新產(chǎn)生質(zhì)粒 的所有相關DNA序列通過測序（Microsynth)來驗證。
[0071]用于酵母單雜奪的六聚鋅指蛋白f庫的克降
[0072] 按照GonzalezB.等，.2010,NatProtoc5,791-810并具有以下改進來克隆含 有結合GNN和/或CNN和/或ANN的鋅指（ZF)模塊的六聚鋅指蛋白文庫。合成編碼GNN， CNN和ANNZF模塊的DNA序列并將其插入pUC57 (GenScript)中，分別產(chǎn)生pAN1049(SEQ IDN0:64)，pAN1073(SEQIDN0:65)和pAN1670(SEQIDN0:66)。在pBluescriptSK(+) 載體中完成鋅指蛋白（ZFP)文庫的逐步裝配。為了避免在每一單獨克隆步驟中插入多個 ZF模塊導致無功能的蛋白，將pBluescript(及其含有1ZFP、2ZFP或3ZFP的衍生產(chǎn)物）和 PAN1049,pAN1073或pAN1670首先與一種限制酶孵育，并隨后用SAP處理。在加入第二種 限制性內(nèi)切核酸酶之前，使用NucleoSpinGel和PCRClean-up試劑盒將酶去除。
[0073]通過用XhoI、SAP并隨后用Spel處理 5μgpBluescript完成pBluescript-lZFPL 的克隆。通過將10μgPAN1049 (釋放16種不同的GNNZF模塊）或pAN1073 (釋放15種 不同的CNNZF模塊）或pAN1670 (釋放15種不同的CNNZF模塊）與Spel、SAP并隨后與 Xhol孵育來產(chǎn)生插入片段。為了產(chǎn)生pBluescript-2ZFPL和pBluescript-3ZFPL，將 7yg pBluescript-lZFPL或pBluescript_2ZFPL用Agel切割，去磷酸化，并用Spel切割。通過 分別向10μgPAN1049或pAN1073或pAN1670應用Spel、SAP和隨后Xmal來獲得插入片 段。通過用Agel、SAP并隨后用Spel處理14μg的pBlueSCript-3ZFPL以獲得切割后的 載體，來完成pBluescript-6ZFPL的克隆。通過用Spel、SAP和隨后Xmal孵育從20μg的 pBluescript_3ZFPL釋放 3ZFPL插入片段。
[0074] 使用200ng切割后的載體、400UT4DNA連接酶在20μ1總體積中并以3:1摩爾比 的插入片段：載體設定含有一個、兩個和三個ZFP的文庫的連接反應，在RT(室溫）下過 夜。六聚鋅指蛋白文庫的連接反應包括在200μ1總體積中的2000ngpBluescript-3ZFPL、 500ng3ZFPL插入片段、4000UT4DNA連接酶，將所述總體積分為10個20μ1，并分別在RT 下孵育過夜。根據(jù)每一文庫所需的克隆數(shù)通過幾種方法將連接反應的部分轉化入大腸桿菌 (Escherichiacoli)中。為了產(chǎn)生pBluescript-lZFPL和pBluescript_2ZFPL，將 3μ1 的 連接反應物直接用于大腸桿菌ΝΕΒ5-α的熱激轉化。pBluescript-3ZFPL的連接反應的 質(zhì)粒DNA使用NucleoSpinGel和PCRClean-up試劑盒純化并轉化入電感受態(tài)大腸桿菌 ΝΕΒ5_α(來自EquiBio的EasyjecTPlus電穿孔儀或來自Eppendorf的多功能細胞電穿 孔儀，2. 5kV和25μF，來自Bio-Rad的2mm電穿孔杯）。將pBluescript-6ZFP文庫的連接 反應物應用于NucleoSpinGel和PCRClean-up試劑盒，并將DNA洗脫在15μ1去離子水 中。將約60ng脫鹽的DNA與50μ1ΝΕΒ1〇-β電感受態(tài)大腸桿菌（NewEnglandBiolabs) 混合，并如制造商建議使用EasyjecTPlus或多功能細胞電穿孔儀、2. 5kV、25μF和2mm電 穿孔杯進行電穿孔。對每一文庫進行多次電穿孔，并隨后直接合并細胞以提高文庫大小。熱 激轉化或電穿孔后，向細菌應用S0C培養(yǎng)基，并在37°C和250rpm下孵育1小時后，將30μ1 的S0C培養(yǎng)物用于連續(xù)稀釋，并鋪至含有氨芐青霉素的LB平板上。第二天，測定獲得的文 庫克隆的總數(shù)。此外，選擇每一文庫的十個克隆以分離質(zhì)粒DNA并通過限制酶消化檢查插 入片段的整合。對這些質(zhì)粒中的至少三個進行測序以驗證文庫的多樣性。將剩余的S0C培 養(yǎng)物轉移至l〇〇ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中并在37°C和250rpm下培養(yǎng)過夜。將那些細 胞用于制備每一文庫的質(zhì)粒MidiDNA。
[0075] 對于酵母單雜交篩選，將六聚鋅指蛋白文庫轉移到相容的獵物載體中。為此目的， 通過用XhoI/EcoRI切割載體并插入退火的寡核苷酸0AN971(TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAG GATATCATGATGACTAGTGGCCAGGCCGGCCC，SEQIDN0:67)和 0AN972(AATTGGGCCGGCCTGGCCAC TAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG，SEQIDN0:68)來修改pGADlO(Clontech)的多 克隆位點。將獲得的載體pAN1025(SEQIDN0:69)切割并去磷酸化，6ZFP文庫插入片段通 過Xhol/Spel從pBluescript_6ZFPL中釋放。如上所述對pBluescript_6ZFP文庫完成連 接反應和電穿孔入NEB10-β電感受態(tài)大腸桿菌中。
[0076] 對于改進的酵母單雜交篩選，將六聚鋅指文庫轉移到改進的獵物載體 pAN1375(SEQIDΝ0:70)中。該獵物載體如下構建：將pRS315(SEQIDΝ0:71)用 Apal/Narl切割并插入退火的 0ΑΝ1143 (CGCCGCATGCATTCATGCAGGCC，SEQIDNO: 72)和 0AN1144(TGCATGAATGCATGCGG，SEQIDN0:73)，產(chǎn)生pAN1373(SEQIDN0:74)。將來自 PAN1025的SphI插入片段連接至用SphI切割的pAN1373內(nèi)以獲得pAN1375。
[0077] 為進一步改善酵母單雜交篩選，也將六聚鋅指文庫轉移到改進的獵物載體 pAN1920(SEQIDNO:75)中。
[0078] 為了進一步改善酵母單雜交篩選，將六聚體鋅指文庫插入獵物載體pAN1992(SEQ IDNO:76)中。<