一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)從世界范圍來(lái)看由于抗生素的過(guò)度使用，造成細(xì)菌性感染和疾病呈上升趨勢(shì)負(fù)面效應(yīng)越來(lái)越大，耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)也越來(lái)越引起人們憂慮，因此尋找、發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)新的抗生素的替代品已列入人們的議事日程?？缛胄率兰o(jì)以來(lái)，抗菌肽(Antibacterialpeptides)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有生物學(xué)活性的小分子多膚，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。由于自身的優(yōu)點(diǎn)已日益引起人們的關(guān)注，并已成為研究的熱點(diǎn)，其中牛乳鐵蛋白肽(Lactoferricin B)，不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等生物學(xué)功能，因此被認(rèn)為是一種新型的抗菌藥物和極具開(kāi)發(fā)潛力的嬰幼兒食品、飼料添加劑。
[0003]最初，日本研究人員發(fā)現(xiàn)天然牛乳鐵蛋白的降解后，其抗菌活性比牛乳鐵蛋白強(qiáng)400多倍，分離提取后發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)為牛乳鐵蛋白肽。然而從天然來(lái)源中分離牛乳鐵蛋白肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜，成本昂貴。此后，商業(yè)上用的牛乳鐵蛋白肽是從牛奶中分離提取牛乳鐵蛋白，再經(jīng)過(guò)生物酶降解產(chǎn)物，產(chǎn)生牛乳鐵蛋白肽。由于所原來(lái)降解牛乳鐵蛋白的生物酶價(jià)格昂貴，因此這種方法生產(chǎn)的牛乳鐵蛋白肽成本仍然較高。而人工合成牛乳鐵蛋白肽及其衍生物費(fèi)用更高，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。目前我國(guó)從新西蘭進(jìn)口的牛乳鐵蛋白每噸價(jià)格為35萬(wàn)美元。盡管如此，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，牛乳鐵蛋白已在歐洲和日本被進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，用于制造母乳化嬰兒配方奶粉或其它功能性食品。因此利用基因工程技術(shù)將牛乳鐵蛋白肽基因轉(zhuǎn)入其它生物中表達(dá)，為解決牛乳鐵蛋白肽來(lái)源不足提供了新的途徑。
[0004]基因工程表達(dá)法將是大量生產(chǎn)抗菌肽的理想途徑。基因工程生產(chǎn)抗菌肽的表達(dá)系統(tǒng)主要是畢赤酵母和大腸桿菌，常選用表達(dá)宿主偏愛(ài)的密碼子人工合成基因并進(jìn)行克隆表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)是最早采用的表達(dá)系統(tǒng)，也是目前應(yīng)用的較為經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要是將目的基因連接到載體上，再對(duì)其進(jìn)行克隆，之后轉(zhuǎn)化至細(xì)菌，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得目的蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)能獲得目的蛋白，而且成本較低。但是，抗菌肽的大量分泌會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生有害作用，因此，目前主要通過(guò)重組蛋白技術(shù)將目的基因同谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶，硫氧還蛋白，綠色熒光蛋白，外殼蛋白，類彈性蛋白，酮類固醇異構(gòu)酶，小分子泛素樣修飾蛋白等融合表達(dá)，降低了抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒性。本研究選擇谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutath1ne S-transferase, GST)作為融合標(biāo)簽，嘗試?yán)么竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備牛乳鐵蛋白肽(LfcinB)抗菌肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于，提供一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法及應(yīng)用，該方法選取氨基酸編碼序列N0.1為目標(biāo)蛋白，然后將氨基酸序列N0.1，轉(zhuǎn)化成核苷酸編碼序列N0.2，并在苷酸編碼序列N0.2設(shè)計(jì)并人工合成兩條反相互補(bǔ)的寡核苷酸鏈上下游引物，在上下兩條引物的5’端分別引入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和Xho I，PCR擴(kuò)增獲得抗菌肽基因片段，分別構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)。超聲裂解菌體，十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，融合蛋白GST-LfcinB成功表達(dá)。融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化后，經(jīng)羥胺剪切緩沖液切割融合蛋白，釋放抗菌肽。通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌和金色葡萄球菌都具有明顯的抑菌活性?？朔伺Ｈ殍F蛋白肽分子量較小而且容易被蛋白酶水解，往往造成產(chǎn)量低，難以產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明所述方法，大大提高了抗菌肽的產(chǎn)量。
[0006]本發(fā)明所述的一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法，按下列步驟進(jìn)行:
[0007]a、抗菌肽LfcinB基因的合成:
[0008]根據(jù)牛乳鐵蛋白肽的基因序列Lf cinB，選取氨基酸編碼序列N0.1:Ac-FKCRRWQffRM KKLGA P-NH為目標(biāo)蛋白，然后將氨基酸序列N0.1，轉(zhuǎn)化成核苷酸編碼序列N0.2:上游 5，-TCA AAT GCT GGC GTT GGC AGT GGC GTT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTC-3，下游 5，-GAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTT CCA-3，，再將核苷酸編碼序列N0.2，設(shè)計(jì)并人工合成兩條反相互補(bǔ)的寡核苷酸鏈上下游引物，在上下兩條引物的5’端分別引入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和Xho I，即得上游引物:5’ -GATCCTTCAAAT GCT GGC GTT GGC AGT GGC GTT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTCTAAC:下游弓丨物:5，-TCGAGTTAGAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTTCCATTGAAG，再將選取的氨基酸編碼序列N0.1目標(biāo)蛋白上游引入羥胺切割蛋白位點(diǎn)天冬酰胺一甘氨酸；
[0009]PCR擴(kuò)增目的抗菌肽基因:
[0010]PCR 反應(yīng)體系:超純水 40yL，10XPCR 含 Mg/緩沖液 5yL，2.5mmol/L dNTPsI μ L，上游引物1.5 μ L，下游引物1.5yL, Taq酶I yL，共計(jì)50yL ;
[0011]反應(yīng)程序?yàn)?溫度940C保持5分鐘后，溫度94°C反應(yīng)30秒，溫度55 °C反應(yīng)30秒，溫度72°C反應(yīng)30秒，共進(jìn)行30循環(huán)后，溫度72°C保持10分鐘；
[0012]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，溫度-20 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0013]b、抗菌肽LfcinB基因重組載體的構(gòu)建:
[0014]將步驟a中PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pGEX_4T_l用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為載體PGEX-4T-142 yL，EcoR I 1.5 μ L，Xho I 1.5 μ L，1XFast Digest 緩沖液5 μ L，Total 50 μ L分別混勻，溫度37°C水浴20min ；
[0015]連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌中，在含有抗生素氨芐青霉素的LB固體平板上挑選轉(zhuǎn)化子，分別接種于含50 μ g/mL氨芐青霉素的4mL LB液體培養(yǎng)基中，溫度37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)8-10h，提取質(zhì)粒后，PCR鑒定，并命名為pGEX-4T-lLfcinB ；
[0016]C、重組抗菌肽LfcinB基因的誘導(dǎo)表達(dá):
[0017]重組菌pGEX-4T-lLfcinB經(jīng)終濃度為lmmol/L異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，與陰性對(duì)照相比，重組菌有明顯濃集的目的蛋白表達(dá)條帶，檢測(cè)目的蛋白，即得牛乳鐵蛋白肽。
[0018]所述方法獲得的牛乳鐵蛋白肽在制備抑制大腸桿菌和金色葡萄球菌中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明所述的一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法，該方法獲得的牛乳鐵蛋白肽經(jīng)谷光甘肽瓊酯糖凝膠一4B (Glutath1ne Sepharose 4B)親和層析凝膠純化融合蛋白結(jié)果:
[0020]大量培養(yǎng)誘導(dǎo)重組表達(dá)菌pGEX-4T_lLfcinB，收集后高壓破碎菌體，離心后分別取上清液和沉淀樣品，三羥甲基甘氨酸一十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)檢測(cè)，結(jié)果顯示上清液和沉淀都有表達(dá)，主要表達(dá)在上清液，上清液經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾除雜后，經(jīng)谷光甘肽瓊酯糖凝膠一4B (Glutath1ne Sepharose 4B)凝膠親和層析純化，用20% Tricine-SDS-PAGE膠電泳檢測(cè)到一條與預(yù)測(cè)分子量大小一致的條帶。
[0021 ] 本發(fā)明所述的一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法，該方法中氨基酸序列No I =Ac-FKCRRWQffRM KKLGA P-NH 2 ;牛乳鐵蛋白肽的基因序列LfcinB，核苷酸編碼序列N0.2:上游5，-TCA AAT GCT GGC GTT GGC AGT GGC GTT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTC-3，下游5’ -GAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTT CCA-3，。其制備方法，構(gòu)建牛乳鐵蛋白肽的基因序列LfcinB氨基酸的核苷酸序列的表達(dá)載體，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，形成可以表達(dá)LfcinB抗菌肽的重組細(xì)胞；培養(yǎng)重組細(xì)胞，使其可以表達(dá)LfcinB抗菌肽；分離細(xì)胞裂解后，用蛋白酶切除去標(biāo)簽，產(chǎn)物具有抗菌活性。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明LfcinB抗菌肽基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0023]圖2為本發(fā)明LfcinB抗菌肽基因重組質(zhì)粒的PCR鑒定圖；
[0024]圖3為本發(fā)明LfcinB抗菌肽基因重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖；
[0025]圖4為本發(fā)明重組LfcinB