塑料袋聯(lián)合聚蔗糖泛影葡胺分離法建立免疫細(xì)胞庫及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用，特別涉及一種免疫細(xì)胞庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]外科手術(shù)、化療、放療是治療惡性腫瘤的常用手段，這些治療方法有一定的侵襲性，會損傷正常細(xì)胞，毒副作用大。免疫細(xì)胞治療腫瘤，能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而不會損傷正常細(xì)胞，毒副作用小，因而被稱為抗腫瘤治療的第四種方法。
[0003]2010年，美國FDA批準(zhǔn)了世界上第一個免疫細(xì)胞治療前列腺癌的藥物，經(jīng)過512例的臨床試驗，可以使前列腺癌患者生存期延長4個月。國內(nèi)很多醫(yī)院也開展免疫細(xì)胞治療腫瘤的臨床研究，廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院報道，采用⑶3單克隆抗體、白細(xì)胞介素2等激活的免疫細(xì)胞，治療23例小細(xì)胞肺癌，有效率78%，1年生存率82%，明顯高于對照組的有效率35%，1年生存率47%。
[0004]免疫細(xì)胞治療腫瘤的程序是，首先采集腫瘤患者靜脈血，送到細(xì)胞工廠，分離靜脈血中的免疫細(xì)胞，加入免疫細(xì)胞培養(yǎng)液，以及重組人白細(xì)胞介素2、r干擾素，CD3單克隆抗體等細(xì)胞因子激活免疫細(xì)胞，放置于C02培養(yǎng)箱中(或者生物反應(yīng)器)培養(yǎng)，免疫細(xì)胞開始增殖，2-3周后，免疫細(xì)胞可增殖數(shù)百倍到一千倍，免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力也大大增強(qiáng)，殺傷性免疫細(xì)胞⑶3+⑶56+雙陽性細(xì)胞比例由1%?2%上升到30%以上，最高可以達(dá)到50%，最后收集免疫細(xì)胞，通過一系列嚴(yán)格的檢測后，將擴(kuò)增的免疫細(xì)胞回輸給腫瘤患者，免疫細(xì)胞在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
[0005]但是，現(xiàn)有的免疫細(xì)胞治療腫瘤的制備程序存在缺陷，因為，治療腫瘤的免疫細(xì)胞來自腫瘤患者，腫瘤患者的免疫細(xì)胞功能受損，殺傷腫瘤細(xì)胞能力低下，盡管采用CD3單克隆抗體、白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子激活，免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力獲得增強(qiáng)，但是依然低于健康人免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力?？茖W(xué)研究也證明這一點。有學(xué)者比較了腫瘤患者和健康人靜脈血免疫細(xì)胞，經(jīng)過CD3單克隆抗體、r干擾素、白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子激活后，第14天，腫瘤患者的免疫細(xì)胞擴(kuò)增95倍，低于健康人145倍；腫瘤患者免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞株K562的能力是44%，低于健康人的62%。這說明，現(xiàn)有的使用腫瘤病人免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞治療的程序并不是最優(yōu)的方案。
[0006]為了克服上述的缺點，因此，在健康狀態(tài)下，將健康人高質(zhì)量的免疫細(xì)胞儲存起來，保管在免疫細(xì)胞庫中，待將來儲存人患腫瘤時用于自體免疫細(xì)胞治療，是一種良好的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]靜脈血中含有紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單個核細(xì)胞(主要是淋巴細(xì)胞，即免疫細(xì)胞)。其中，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大于1.077，單個核細(xì)胞比重小于1.077，聚蔗糖泛影葡胺是一種密度介于1.077-1.090之間而近似于等滲的溶液，將靜脈血置于聚蔗糖泛影葡胺界面上，通過離心，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞會沉淀，單個核細(xì)胞會浮在聚蔗糖泛影葡胺界面上，這樣就把免疫細(xì)胞(其中95%是淋巴細(xì)胞)分離出來。
[0008]現(xiàn)有的分離免疫細(xì)胞技術(shù)方案是，先用注射器采集靜脈血，然后取15ml或者50ml離心管，加入適量體積的聚蔗糖泛影葡胺溶液于離心管底部，然后加入經(jīng)過生理鹽水稀釋的靜脈血于聚蔗糖泛影葡胺界面上，蓋上離心管蓋，擰緊，然后離心，紅細(xì)胞和粒細(xì)胞沉淀于離心管底部，免疫細(xì)胞位于中間層，離心完畢，打開離心管蓋，吸取免疫細(xì)胞。這種分離法，操作過程全部是敞開的，免疫細(xì)胞完全暴露在空氣中，容易受到細(xì)菌污染。
[0009]為了克服上述缺點，本發(fā)明采用帶針頭的塑料袋采集靜脈血，使用帶有導(dǎo)管的塑料袋分離免疫細(xì)胞，使用塑料袋收集免疫細(xì)胞，全部操作均在密閉的塑料袋中，操作簡便，避免細(xì)菌污染。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0011](1)使用帶針頭的塑料袋采集健康人靜脈血30?100mL，肝素抗凝，取其中靜脈血2?5mL，檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體、厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)、血細(xì)胞三分類檢測、免疫細(xì)胞CD3、CD4、CD56、CD8檢測。
[0012](2)步驟⑴所獲得的靜脈血，按照質(zhì)量/體積比1: 1的比例，加入1倍體積的生理鹽水，充分混勻。
[0013](3)取帶導(dǎo)管塑料袋一只，按照稀釋靜脈血質(zhì)量/體積比1: 1/3?1/4的比例，通過導(dǎo)管加入1/3?1/4體積的聚蔗糖泛影葡胺溶液于塑料袋中。
[0014](4)將步驟(2)所獲得靜脈血稀釋液，緩慢的通過導(dǎo)管，加入到步驟(3)所獲得含有聚蔗糖泛影葡胺的塑料袋中，并置于聚蔗糖泛影葡胺溶液界面上。
[0015](5)步驟⑷所得的塑料袋，22°C離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1800?2000轉(zhuǎn)/分鐘，時間18?20分鐘。靜脈血稀釋液分2層，下層沉淀是紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，上層是血漿，中間層是一層白膜，含有大量的免疫細(xì)胞。
[0016](6)步驟(5)含白膜層的塑料袋，懸于壓漿板上，操作壓漿板，將塑料袋中的白膜層和血漿通過導(dǎo)管擠壓到另外一只塑料袋中。
[0017](7)步驟(6)所獲得的含白膜層和血漿的塑料袋，再離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時間10?15分鐘，免疫細(xì)胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細(xì)胞。
[0018](8)步驟(7)獲得免疫細(xì)胞中，加入冷凍保護(hù)劑，經(jīng)過程序降溫，降溫速率為-1°C?-3°c /分鐘，溫度降至-80°c?-90°c后，置于液氮中冷凍保存，并建立可供檢索的免疫細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建人免疫細(xì)胞庫。
[0019]其中，冷凍保護(hù)劑是含10% (體積百分比)二甲基亞砜免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由90%的(體積百分比)無血清免疫細(xì)胞培養(yǎng)基含10% (體積百分比)10%白蛋白構(gòu)成。
[0020]以上全過程均在無菌環(huán)境中進(jìn)行操作。
[0021]本發(fā)明所獲得的免疫細(xì)胞，解凍后，免疫細(xì)胞活力達(dá)到90%以上，按照免疫細(xì)胞濃度0.5?lX106/mL，接種于塑料培養(yǎng)袋，用無血清免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，加入白細(xì)胞介素2、r干擾素、⑶3單克隆抗體，10%白蛋白，置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，免疫細(xì)胞開始擴(kuò)增，每培養(yǎng)3?4天檢測免疫細(xì)胞數(shù)量，添加新鮮免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，使免疫細(xì)胞終濃度0.5?1 X 106/mL, 20天后，免疫細(xì)胞擴(kuò)增800?1000倍，在原始免疫細(xì)胞接種10X 106情況下，可收集高達(dá)1 X 101°免疫細(xì)胞，用于臨床治療腫瘤。
[0022]本發(fā)明所述的一種免疫細(xì)胞庫構(gòu)建方法，可以從健康人靜脈血中獲得免疫細(xì)胞，建立免疫細(xì)胞儲存庫，根據(jù)本發(fā)明的方法，儲存于庫內(nèi)的免疫細(xì)胞，可以經(jīng)過激活、擴(kuò)增、獲得大量具有強(qiáng)大殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，用于治療自身腫瘤。并且，能夠長時間保存而不喪失活性，操作簡便，建庫成本低，具有應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例中，所用的原料或者試劑除特別說明外，均為市售可得。
[0024]實施例1
[0025]免疫細(xì)胞采集分離:
[0026](1)使用帶針頭的塑料袋采集健康人靜脈血30?100mL，肝素抗凝，取其中靜脈血2?5mL，檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體、厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)、血細(xì)胞三分類檢測、免疫細(xì)胞CD3、CD4、CD56、CD8檢測。
[0027](2)步驟⑴所獲得的靜脈血，按照質(zhì)量/體積比1: 1的比例，加入1倍體積的生理鹽水，充分混勻。
[0028](3)取帶導(dǎo)管塑料袋一只，按照稀釋靜脈血質(zhì)量/體積比1: 1/3?1/4的比例，通過導(dǎo)管加入1/3?1/4體積的聚蔗糖泛影葡胺溶液于塑料袋中。
[0029](4)將步驟(2)所獲得靜脈血稀釋液，緩慢的通過導(dǎo)管，加入到步驟(3)所獲得含有聚蔗糖泛影葡胺的塑料袋中，并置于聚蔗糖泛影葡胺溶液界面上。
[0030](5)步驟(4)所得的塑料袋，22°C離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1800?2000轉(zhuǎn)/分鐘，時間18?20分鐘。靜脈血稀釋液分2層，下層沉淀是紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，上層是血漿，中間層是一層白膜，含有大量的免疫細(xì)胞。
[0031](6)步驟(5)含白膜層的塑料袋，懸于壓漿板上，操作壓漿板，將塑料袋中的白膜層和血漿通過導(dǎo)管擠壓到另外一只塑料袋中。
[0032](7)步驟(6)所獲得的含白膜層和血漿的塑料袋，再離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時間10?15分鐘，免疫細(xì)胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細(xì)胞。