一種雞樅菌的dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種雞樅菌的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞樅，隸屬真菌類擔(dān)子菌綱傘菌目傘菌科。我們常說的雞樅菌是一類與大白蟻亞 科(Macrotermitinae)的某些種特異性共生的真菌，故又名蟻巢傘或白蟻傘。雞縱菌被稱 為野生食用菌之王，其肉質(zhì)肥厚、質(zhì)細(xì)絲白、脆嫩爽□、清香鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，含有I丐、鎂、鐵、 蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，富含磷，含有20多種氨基酸。此外，雞樅菌中還含有治療糖尿病的 有效成分，對(duì)降低血糖有明顯的效果。雞樅菌是人們食用和送禮的首選，市場(chǎng)需要在逐年增 加。最新版的《真菌字典》（Ainsworth Bisby's Disctionary of the Fungi)共記錄和描 述了全世界的40個(gè)雞樅菌物種，而云南地區(qū)的雞樅菌物種就達(dá)到20種，可見云南地區(qū)雞 樅菌種類之豐富。據(jù)估計(jì)，云南每年的雞樅菌產(chǎn)量在2000噸左右。但是，近年來由于市場(chǎng) 需求加大，雞樅菌的自然群體面臨著被過度采摘的威脅；加之隨著生態(tài)環(huán)境的破壞，雞樅菌 的棲息環(huán)境正在變得越來越少，野生雞樅菌種質(zhì)資源受到了嚴(yán)重的威脅，對(duì)野生雞樅菌的 保護(hù)迫在眉睫。另一方面，由于對(duì)雞樅種質(zhì)資源缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知，雞樅菌市場(chǎng)上種類魚目混 雜，優(yōu)劣不等，不良商販以次充好、以假充真的現(xiàn)象屢見不鮮。民間多根據(jù)雞樅的顏色，分為 黑皮、白皮、黃皮、花皮等許多類型，味道以黑皮(青皮）雞樅最好，有人還根據(jù)雞樅菌蓋的形 狀分類，認(rèn)為質(zhì)量最好的是蒜頭雞樅，次為開雞樅，再次為火把雞樅，但是這些形態(tài)特征多 受到雞樅發(fā)育程度和生長(zhǎng)環(huán)境的影響，帶有極大的人為因素。另外，由于公眾缺乏對(duì)野生雞 樅菌的準(zhǔn)確鑒別能力，食用毒蘑菇導(dǎo)致死亡的事件時(shí)有發(fā)生。因此，急需建立其分子鑒定方 法，通過形態(tài)型劃分與分子數(shù)據(jù)分析相結(jié)合的方法來解決其鑒別和分類問題，并通過這些 分子數(shù)據(jù)研究其遺傳多樣性，揭示雞樅菌在云南地區(qū)的遺傳分布和群體結(jié)構(gòu)，為雞樅菌的 資源保護(hù)提供理論參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服形態(tài)學(xué)鑒定雞樅菌存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種雞樅菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn) 基因序列及鑒定方法，可以快速準(zhǔn)確地將該物種從易混淆物種或復(fù)合種中鑒定出來。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種雞樅菌的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列SEQ ID NO. 1 : ATCTTCGTCGATGTAACACGCCCCTAGGACGAGAGGGCAAGATTGCCAAACCCCGTCAATTGCATAATACC CATTGGGGAATGGTCTGYCCCGCGGAGACGCCAGAAGGTCAAGCGTGTGGACTCGTTAAAAATCTTGCTCTAATGT CATGCATCTCTGTCGGGTCATACTCTGCACCTGTTATTGAATTTTTAGAGGAGTGGGGTTTGGAGTCACTGGAAGAA AATGCTCATTCTTCCACTCCTTGCACAAAGGTCTTTGTTAATGGTGTCTGGATGGGCGTCCATCGCGATCCCGCAAA CTTGGTGAAGACTATCAAAAAGTTGCGACGCAAAGACGACATAAGTCCTGAAGTTTCTGTTGTACGGGATATCAGGG AAAAAGAACTACGGCTCTACACAGACGCTGGCCGCGTCTGCCGGCCCCTGTTTATCGTGGAAAATCAACAGCTTGCG CTTGAGAAGAAGCACGTTCGCTGGCTCAGCAACGGGAAAGATGATAACGGAGCTGAGTACAAATGGGAATCGTTGGT CAAGGGTGGCGTAGTCGAGCTCTTGGAT GCAGAAGAGGAGGAAACAGTTATGATATCAATGACTCCAGAAGATCTTGARACTTCCAGATTGCAACAGAGTG GTGTCAACCCCGCTGTTAATGAAGATTTTGACCCTGCAGCTCGACTCAAAGCCGGAATCAACTCACAC〇
[0005] 應(yīng)用權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行分子鑒定方法包括以下4個(gè)步驟： (1) 從樣品組織中分離提取基因組DNA; (2) 以步驟（1)所提取的基因組DNA為模板，用雞樅菌RPB2特異性引物，進(jìn)行聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； (3) 對(duì)步驟（2)擴(kuò)增得到的DNA產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序； (4) 將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行手工拼接，與所述基因序列RPB2的進(jìn)行同源性比對(duì)，若同源性在 99%以上，即可將該樣品鑒定為雞縱菌（cXrjOeaiiAs·)。
[0006] 進(jìn)一步，所述的RPB2特異性引物的引物序列為： RPB2B-f: 5' -CCGCAAAGGCTGGTGTATC-3' ， RPB2B-r: 5? -TTCGAATGAGTTCAAGTGT-3?； 進(jìn)一步，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性3min，接下來94°C變性30s， 50°C退火1min，72°C延伸1. 5min，一共進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0007] (1)根據(jù)DNA條形碼技術(shù)原理，采用PCR擴(kuò)增方法，確保條帶的純度及可靠性。測(cè) 序結(jié)果通過手工校對(duì)、序列拼接，并確保所得序列為標(biāo)準(zhǔn)序列。從采集的雞樅菌樣品提取基 因組DNA，利用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增出樣品的RPB2基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后 分析比對(duì)，優(yōu)選SEQIDNO. 1引物序列擴(kuò)增樣品的RPB2基因序列片段作為標(biāo)準(zhǔn)基因。為了 實(shí)現(xiàn)上述目的，一種用于雞樅菌分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因如下所述的基因序列SEQIDNO. 1 : ATCTTCGTCGATGTAACACGCCCCTAGGACGAGAGGGCAAGATTGCCAAACCCCGTCAATTGCATAATACC CATTGGGGAATGGTCTGYCCCGCGGAGACGCCAGAAGGTCAAGCGTGTGGACTCGTTAAAAATCTTGCTCTAATGT CATGCATCTCTGTCGGGTCATACTCTGCACCTGTTATTGAATTTTTAGAGGAGTGGGGTTTGGAGTCACTGGAAGAA AATGCTCATTCTTCCACTCCTTGCACAAAGGTCTTTGTTAATGGTGTCTGGATGGGCGTCCATCGCGATCCCGCAAA CTTGGTGAAGACTATCAAAAAGTTGCGACGCAAAGACGACATAAGTCCTGAAGTTTCTGTTGTACGGGATATCAGGG AAAAAGAACTACGGCTCTACACAGACGCTGGCCGCGTCTGCCGGCCCCTGTTTATCGTGGAAAATCAACAGCTTGCG CTTGAGAAGAAGCACGTTCGCTGGCTCAGCAACGGGAAAGATGATAACGGAGCTGAGTACAAATGGGAATCGTTGGT CAAGGGTGGCGTAGTCGAGCTCTTGGAT GCAGAAGAGGAGGAAACAGTTATGATATCAATGACTCCAGAAGATCTTGARACTTCCAGATTGCAACAGAGTG GTGTCAACCCCGCTGTTAATGAAGATTTTGACCCTGCAGCTCGACTCAAAGCCGGAATCAACTCACAC〇
[0008] (2)樣品的鑒別：通過將待鑒別的樣品序列與標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行比對(duì)，基于同源性和基 于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則來鑒別物種，獲得序列間的相似性，相似度最高 或匹配度最高或遺傳距離最近的對(duì)應(yīng)物種即為待鑒別的物種；具體如下： a.基于同源性鑒定規(guī)則來鑒別物種 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，如果與所述基因序列SEQIDNO. 1的同源性在99%以上，即可判斷所述 的待測(cè)樣品為尖盾白蟻傘（c乂
[0009]b.基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則來鑒別物種 將標(biāo)準(zhǔn)基因序列和待鑒定的樣品序列與雞樅菌其他種內(nèi)的RPB2序列合并應(yīng)用MEGA或 PAUP軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，檢驗(yàn)未鑒定樣品的DNA條形碼序列與標(biāo)準(zhǔn)基因序列聚類在 一起的物種，若未知樣品與數(shù)據(jù)庫中的物種構(gòu)成單支系，則鑒定為該物種。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1、優(yōu)選RPB2基因作為最適合鑒別尖盾白蟻傘（