一種用于生物樣本核酸檢測(cè)的質(zhì)控方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生化檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種用于生物樣本核酸檢測(cè)的質(zhì)控方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因分型(Genotyping)是利用生物學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定個(gè)體基因型(Genotype)的技術(shù)，又稱為基因型分析(Genotypic assay)，使用技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、DNA片段分析、寡核苷酸探針(ASO probes)、基因測(cè)序、核酸雜交、基因芯片技術(shù)等。
[0003]SNP，全稱Single Nucleotide Polymorphism，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。SNP是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500?1000個(gè)堿基對(duì)中就有I個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。目前，國(guó)內(nèi)外已有的SNP分型檢測(cè)技術(shù)中有以下幾種，高分辨率融解曲線檢測(cè)法(high resolut1n melting，HRM)、基于芯片技術(shù)的SNP分型方法、等位基因特異性擴(kuò)增法(Amplificat1n Refractory Mutat1n System Real TimePCR，ARMS-RT PCR)、Taqman熒光探針?lè)ā①|(zhì)譜法和高效液相層析法等。
[0004]SNP決定群體和個(gè)體基因序列的細(xì)微差別，科學(xué)家可憑此找到疾病的易感基因，并使個(gè)體化醫(yī)療成為可能。先前的研究證實(shí)，人類的大部分疾病，如三分之二的腫瘤可以被預(yù)防；而通過(guò)基因易感性分析，我們便能夠確定特定疾病的高發(fā)性人群，以對(duì)該群人進(jìn)行生活或飲食方式的干預(yù)、促進(jìn)其健康。這些研究將會(huì)為全人類的疾病預(yù)防產(chǎn)生巨大貢獻(xiàn)。此外，通過(guò)對(duì)藥物代謝相關(guān)基因的SNP研究，還能夠闡明不同患者間藥物代謝及藥效差異的遺傳基礎(chǔ)，可根據(jù)不同患者遺傳背景，來(lái)優(yōu)化治療方案，減少不必要的藥物浪費(fèi)。
[0005]核酸相關(guān)的檢測(cè)在醫(yī)療領(lǐng)域中以疾病的臨床分子診斷最具代表性，其檢測(cè)快速尚效、結(jié)果準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)，但由于樣本量大導(dǎo)致操作步驟易出錯(cuò)、對(duì)檢測(cè)本身的質(zhì)控手段單一等缺點(diǎn)也逐漸突顯出來(lái)。另外，最小等位基因頻率對(duì)于基因分型結(jié)果的影響也是顯而易見(jiàn)的。最小等位基因頻率(Minor AlIeleFrequency,MAF)通常是指在給定人群中的不常見(jiàn)的等位基因發(fā)生頻率，例如AA、Aa、aa三個(gè)基因型，在人群中A的頻率=0.9，a的頻率=0.1，則等位基因a就為最小等位基因(也稱為罕見(jiàn)基因)，MAF = 0.1，等位基因A稱為常見(jiàn)基因。那么以100個(gè)樣本為例，在基因分型檢測(cè)過(guò)程中，理論上存在81個(gè)、18個(gè)和I個(gè)樣本分別聚成三個(gè)聚類，由于三個(gè)聚類中樣本數(shù)量的明顯差異，實(shí)際分析過(guò)程中聚類結(jié)果的準(zhǔn)確性受到重要影響，可以預(yù)見(jiàn)的是，MAF值越低，聚類結(jié)果的準(zhǔn)確性越低，基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性也就越低，而目前沒(méi)有較好的質(zhì)控方法來(lái)解決這一問(wèn)題。
[0006]有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種用于生物樣本核酸檢測(cè)的質(zhì)控方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種可以有效降低最小等位基因頻率對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響程度、有效提高檢測(cè)準(zhǔn)確性的用于生物樣本核酸檢測(cè)的質(zhì)控方法。
[0008]本發(fā)明的用于生物樣本核酸檢測(cè)的質(zhì)控方法，包括以下步驟:
[0009]I)采集多個(gè)待測(cè)生物樣本并提取樣本DNA備用；
[0010]2)制備質(zhì)控DNA以備用，所述質(zhì)控DNA包括常見(jiàn)純合型質(zhì)控DNA (CC樣本)、雜合型質(zhì)控DNA (CR樣本)和罕見(jiàn)純合型質(zhì)控DNA (RR樣本)，所述常見(jiàn)純合型質(zhì)控DNA為包含所有待檢SNP位點(diǎn)DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均為純合的常見(jiàn)基因；所述雜合型質(zhì)控DNA為所有待檢SNP位點(diǎn)DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均為雜合型；所述罕見(jiàn)純合型質(zhì)控DNA為所有待檢SNP位點(diǎn)DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均為純合的罕見(jiàn)基因；其中，C代表Common，R代表Rare，CC表示常見(jiàn)基因純合型，CR代表雜合型，RR代表罕見(jiàn)基因純合型。
[0011]3)將樣本DNA和質(zhì)控DNA —起進(jìn)行基因分型檢測(cè)；
[0012]4)以質(zhì)控DNA的檢測(cè)結(jié)果作為參照進(jìn)行基因分型分析。
[0013]CC、CR和RR樣本的作用在于，當(dāng)對(duì)某一 SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，這三個(gè)質(zhì)控DNA樣本在基因分型檢測(cè)的聚類圖上會(huì)形成具有參照作用的位置點(diǎn)，輔助分析樣本DNA的聚類結(jié)果，即使某一 SNP位點(diǎn)的MAF值較低，樣本DNA的分型結(jié)果并不能形成明顯的聚類，也可以根據(jù)這三個(gè)質(zhì)控DNA樣本進(jìn)行聚類的輔助定位分析，有效降低最小等位基因頻率對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響程度，有效提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。
[0014]應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明中的CC、CR和RR樣本并不局限于每種一個(gè)、共計(jì)三個(gè)質(zhì)控DNA,可以根據(jù)實(shí)際使用需求設(shè)置為每種質(zhì)控DNA大于或等于2個(gè)，以提高質(zhì)控的效果，這樣在基因分型檢測(cè)的聚類圖上，每一聚類下存在2個(gè)或2個(gè)以上的具有參照作用的位置點(diǎn)，相對(duì)驗(yàn)證，并輔助分析樣本DNA的聚類結(jié)果。
[0015]進(jìn)一步的，還包括參照DNA (Reference DNA)，所述參照DNA上與待檢SNP位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的基因分型信息為已知；所述步驟3)中參照DNA與樣本DNA和質(zhì)控DNA —起進(jìn)行基因分型檢測(cè)，所述步驟4)中以參照DNA和質(zhì)控DNA的檢測(cè)結(jié)果作為參照進(jìn)行基因分型分析。
[0016]參照DNA的作用在于，通過(guò)加入已知基因分型信息的DNA，經(jīng)過(guò)基因分型檢測(cè)分析，將檢測(cè)結(jié)果與已知信息進(jìn)行核對(duì)，以判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否存在污染、錯(cuò)加樣等影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問(wèn)題，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證Ce、CR和RR等質(zhì)控DNA對(duì)于基因分析結(jié)果的影響。若參照DNA的檢測(cè)結(jié)果與已知信息一致，則在一定程度上證明質(zhì)控DNA的有效性。
[0017]具體的，所述參照DNA包括至少2種(REF1，REF2等)；應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，參照DNA設(shè)置為2個(gè)或2個(gè)以上，其目的在于形成相互間的對(duì)照，若兩個(gè)參照DNA的結(jié)果均與已知基因分型信息一致，則質(zhì)控DNA、以及整體實(shí)驗(yàn)方案的有效性可得到進(jìn)一步驗(yàn)證，若部分參照DNA的結(jié)果與已知基因分型信息一致，則需同時(shí)考慮參照DNA已知信息的準(zhǔn)確性和整體實(shí)驗(yàn)方案的有效性，其中已知信息的準(zhǔn)確性可通過(guò)對(duì)參照DNA的進(jìn)一步測(cè)序得到驗(yàn)證，若所有參照DNA的結(jié)果與已知基因分型信息均不一致，則整體實(shí)驗(yàn)方案需要進(jìn)一步核查。
[0018]進(jìn)一步的，還包括空白對(duì)照DNA(NTC，no template control)，所述空白對(duì)照DNA與樣本DNA和質(zhì)控DNA —起進(jìn)行基因分型檢測(cè)。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，該NTC樣本在基因分型檢測(cè)結(jié)果中，應(yīng)當(dāng)體現(xiàn)為無(wú)熒光、不聚類，若其結(jié)果發(fā)生變化，則表明整體實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能發(fā)生了污染，需要重新取樣。
[0019]進(jìn)一步的，所述質(zhì)控DNA經(jīng)過(guò)以下步驟獲得:
[0020]S1、擴(kuò)增:采集目標(biāo)樣本的DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增待檢SNP位點(diǎn)的基因片段；
[0021]S2、連接:將基因片段與載體連接轉(zhuǎn)化入細(xì)菌中培養(yǎng)；
[0022]S3、測(cè)序:挑選菌落后，PCR擴(kuò)增測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果為純合基因型，則進(jìn)行下一步堿基突變擴(kuò)增、以獲得不同等位基因的DNA模板，若測(cè)序結(jié)果為雜合基因型，則挑選不同等位基因的DNA模板備用；
[0023]S4、堿基突變擴(kuò)增:挑選上述檢測(cè)結(jié)果為純合基因型的菌落，加入堿基突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得相對(duì)等位基因的DNA模板備用；
[0024]S5、制備:將每一待檢SNP位點(diǎn)的不同等位基因的DNA模板按基因型分別收集或混合為單一位點(diǎn)DNA模板，所述質(zhì)控DNA模板由相同基因型下的所有單一位點(diǎn)DNA模板混合而成，所述基因型包括純合的常見(jiàn)基因、雜合型和純合的罕見(jiàn)基因三種。
[0025]進(jìn)一步的，所述載體為質(zhì)粒；應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明中的載體是指，能將分離或合成的基