α-突觸核蛋白抗體及其用圖
【專利說(shuō)明】a-突觸核蛋白抗體及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及對(duì)a-突觸核蛋白聚合體（例如淀粉樣纖維、初原纖維或低聚物）具 有高結(jié)合親和力且對(duì)a-突觸核蛋白低聚物具有低結(jié)合親和力的抗體或其片段。本發(fā)明還 涉及這些抗體及片段在診斷、治療和預(yù)防與a-突觸核蛋白相關(guān)的神經(jīng)病理中的用途。
[0002] 背景
[0003] 突觸核蛋白是小分子蛋白家族，約14kDa，其在神經(jīng)組織中高水平表達(dá)。該家族的 三個(gè)成員是a-突觸核蛋白、(6-突觸核蛋白和y-突觸核蛋白。
[0004]a-突觸核蛋白主要在腦組織中表達(dá)，并主要位于突觸前神經(jīng)元末梢。人類形式的 a_突觸核蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由140個(gè)氨基酸的多肽構(gòu)成。人類a-突觸核蛋白的野生型 序列可見(jiàn)于圖20(SEQIDN0:49)。a-突觸核蛋白通常以可溶性單體蛋白存在，但根據(jù)其 環(huán)境可采用若干不同的折疊構(gòu)象。單體a-突觸核蛋白也可以聚合成低聚物和高分子量不 溶性纖維。
[0005] 與突觸核蛋白異常相關(guān)的疾病通常被稱為共核蛋白?。╯ynucleinopathy)。共 核蛋白病包括神經(jīng)退行性疾病、帕金森氏?。≒D)、路易氏體失智癥（DLB)和多系統(tǒng)萎縮癥 (MSA)。在共核蛋白病中，已表明，在和DLB的腦勻漿中可溶性a-突觸核蛋白低聚物與 正常腦相比要高。此外，常常表征和DLB晚期的神經(jīng)病理性病變（路易氏體）已經(jīng)基本 上被認(rèn)為是由纖維狀a-突觸核蛋白沉積物組成。
[0006] 市售a-突觸核蛋白抗體是已知的，并且被廣泛地用于表征腦中的病理。然而， 這種抗體是非特異性的，并且既識(shí)別a-突觸核蛋白的單體形式又識(shí)別a-突觸核蛋白的 聚合形式，并且無(wú)法識(shí)別a-突觸核蛋白的所有聚合形式。
[0007] 已知的a-突觸核蛋白抗體包括Syn-I(BD生物科學(xué)（BDBiosciences))和 mAb211 (圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（SantaCruzBiotechnology))，已知它們同樣結(jié)合 a_突觸核蛋白的單體形式和聚合形式。
[0008]W02011/104696公開(kāi)了特異性識(shí)別初原纖維形式的a-突觸核蛋白的抗體。這些 抗體顯示與a_突觸核蛋白原纖維和單體的低結(jié)合親和力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明涉及對(duì)a_突觸核蛋白聚合體具有高結(jié)合親和力且對(duì)單體形式的a_突觸 核蛋白具有低結(jié)合親和力的抗體及其片段。
[0010] 本發(fā)明還涉及包含這種抗體或其片段的組合物、使用所述抗體或片段檢測(cè)a_突 觸核蛋白聚合體的存在的方法，以及它們?cè)谠\斷與a-突觸核蛋白相關(guān)的疾病中的用途。
[0011] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含這種抗體或其片段的組合物和使用所述抗體 或片段治療或預(yù)防與a-突觸核蛋白的病理相關(guān)的疾病的方法。
[0012] 使用對(duì)a_突觸核蛋白聚合體有特異性的抗體可幫助揭示新的和其它共核蛋 白病的病理。
[0013] 通過(guò)產(chǎn)生對(duì)a_突觸核蛋白聚合體有特異性并對(duì)a_突觸核蛋白單體具有低結(jié)合 親和力的抗體，本發(fā)明提供了跟蹤與a-突觸核蛋白相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展的新工 具。本發(fā)明的抗體還提供了可用于治療與a-突觸核蛋白相關(guān)的疾病的抗體。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 現(xiàn)在將通過(guò)舉例并參考附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，在附圖中：
[0015] 圖1示出如實(shí)施例1中所描述的用a-突觸核蛋白原纖維免疫的宿主（宿主19、 22和23)和用a-突觸核蛋白低聚物免疫的宿主（宿主210、211和212)的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果。
[0016] 圖2示出如實(shí)施例2所描述的用于篩選雜交瘤對(duì)a-突觸核蛋白聚合體（原纖維 (F)、低聚物（0)和單體（M))的特異性的點(diǎn)圖（dotplots)結(jié)果。
[0017] 圖3示出如實(shí)施例4所描述的使用抗體Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及對(duì)照Syn-I抗體（BD生物科學(xué)（BDBiosciences))進(jìn)行的抑制ELISA的結(jié) 果。
[0018] 圖4示出如實(shí)施例5⑷所描述的抗體Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及Syn-I與由不同蛋白形成的淀粉樣纖維的交叉反應(yīng)性的結(jié)果。
[0019]圖 5 示出如實(shí)施例 5(B)所描述的抗體Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及Syn-I與由0 -突觸核蛋白和y-突觸核蛋白形成的淀粉樣纖維的交叉反 應(yīng)性。
[0020] 圖 6 示出如實(shí)施例 5 (C)所描述的抗體Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及Syn-I與由a-突觸核蛋白肽NAC(61-98)、NAC(61-75)和截?cái)嘈蚢-突觸 核蛋白（1-122)形成的淀粉樣纖維的交叉反應(yīng)性。
[0021] 圖7示出如實(shí)施例6所描述的使用Biacore的對(duì)于單克隆抗體（mAb)Syn-Fl、 Syn-F2、Syn-Ol、Syn-02、Syn-03 和Syn-04 以及mAb211 (圣克魯斯生物技術(shù)有限公司（Santa CruzBiotechnology))的傳感圖結(jié)果。
[0022] 圖8示出如實(shí)施例7所描述的用于表位確定而通過(guò)斑點(diǎn)雜交進(jìn)行的對(duì)于mAb Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04,以及Syn-I抗體（對(duì)照）的肽掃描結(jié) 果。
[0023] 圖9示出如實(shí)施例7所描述的通過(guò)ELISA進(jìn)行的肽掃描的結(jié)果。用本發(fā)明的單克 隆抗體A)Syn-Fl、B)Syn-F2、C)Syn-01、D)Syn-02、E)Syn-03 和F)Syn-04,或者用對(duì)照抗體 G)Syn211、H)N-19、I)FL-140、J)Syn-l、K)3B6 和L)5C2 探測(cè)板。
[0024]圖10示出如實(shí)施例7所描述的對(duì)放置在肽掃描ELISA的板上的X射線膠片的繪 圖。對(duì)照抗體119、？1-140、502、3711-1、3711-211、386的繪圖示于圖10仏）中。本發(fā)明的 抗體Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04 示于圖 10(B)中。
[0025] 圖11示出如實(shí)施例8所描述的用于檢測(cè)a-突觸核蛋白聚合體的夾心ELISA的 結(jié)果?？贵wSyn-Fl、Syn_F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04,以及Syn-I抗體被用作捕 獲抗體，F(xiàn)L-140被用作檢測(cè)抗體。
[0026] 圖12示出如實(shí)施例9所描述的用于檢測(cè)磷酸化Serl29-a-突觸核蛋白聚合 體的夾心ELISA的結(jié)果。抗體Syn-02和Syn-F2,以及Syn-I被用作捕獲抗體，并且兔抗 P-S129-a-突觸核蛋白被用作檢測(cè)抗體。
[0027]圖13示出如實(shí)施例10所描述的來(lái)自未患帕金森氏病的受試者的對(duì)照病例的組織 的免疫組織化學(xué)分析。
[0028] 圖14示出如實(shí)施例10所描述的來(lái)自帕金森氏病病例的組織的免疫組織化學(xué)分 析。
[0029] 圖15示出如實(shí)施例10所描述的來(lái)自多系統(tǒng)萎縮病例的組織的免疫組織化學(xué)分 析。
[0030] 圖16示出如實(shí)施例11所描述的來(lái)自帕金森載體ro患者（A)、漸進(jìn)性DLB患者（B) 和典型患者的組織樣品中Syn-02染色的結(jié)果。
[0031] 圖17示出如實(shí)施例12所描述的來(lái)自海馬CA2區(qū)（A)和內(nèi)嗅皮層神經(jīng)突⑶的腦 切片的處理的用Syn-F2抗體染色的結(jié)果。切片進(jìn)行以下處理：1)未處理，2)在檸檬酸鹽緩 沖液中在120°C下高壓滅菌10分鐘，3)甲酸15分鐘，或4)20yg/ml蛋白酶K處理。具有 Syn-I抗體的對(duì)照5)在已用甲酸處理15分鐘的組織樣品上進(jìn)行。
[0032] 圖18示出如實(shí)施例14所描述的通過(guò)BiFC熒光分析顯示形成斑點(diǎn)（箭頭）而獲 得的圖像。
[0033] 圖19示出如實(shí)施例14所描述的每個(gè)測(cè)試抗體的斑點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比％。
[0034] 圖20示出人類a-突觸核蛋白的野生型序列。
[0035] 詳述
[0036] 本發(fā)明涉及對(duì)a-突觸核蛋白聚合體具有高結(jié)合親和力且對(duì)a-突觸核蛋白單體 具有低結(jié)合親和力的抗體。相比結(jié)合a-突觸核蛋白單體形式，所述抗體具有提高的結(jié)合 a_突觸核蛋白聚合體的親和力。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對(duì)a-突觸核蛋白聚合體具有高結(jié)合親和力且對(duì) a_突觸核蛋白單體具有低結(jié)合親和力的抗體或其片段。
[0038] 除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)a_突觸核蛋白聚合體意圖涵蓋早期的可溶性聚合體形式的 a_突觸核蛋白（例如低分子量和高分子量可溶性低聚物，包括初原纖維）和成熟的不可溶 性聚合體形式的a-突觸核蛋白（例如成熟原纖維）。具體而言，所述抗體及其片段具有對(duì) a_突觸核蛋白原纖維的高結(jié)合親和力，和對(duì)a_突觸核蛋白低聚物的高結(jié)合親和力。
[0039] 對(duì)a_突觸核蛋白聚合體具有高親和力意思是所述抗體或片段顯示對(duì)于a_突觸 核蛋白聚合體的解離常數(shù)Kd小于10 7M。優(yōu)選地，所述抗體顯示Kd小于10SM，或小于10 9M, 或甚至更優(yōu)選地，Kd小于IOwM,或甚至小于10nM。優(yōu)選地，所述a-突觸核蛋白是人類 a-突觸核蛋白。
[0040] 原纖維是不溶性高分子量聚合形式的a-突觸核蛋白。
[0041] 可溶性低聚形式的a-突觸核蛋白以各種尺寸和形態(tài)出現(xiàn)，并包括二聚體、三聚 體、四聚體和多聚體。初原纖維是從單體形式形成a-突觸核蛋白原纖維的途徑中的中間 步驟。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)低聚形式的a-突觸核蛋白時(shí)，也意圖包括初原纖維。
[0042] 抗體的其片段意思是其活性片段，即具有用于限定根據(jù)本發(fā)明的抗體的相同特征 的片段，也就是對(duì)a-突觸核蛋白聚合體有高親和力且對(duì)a-突觸核蛋白單體有低結(jié)合親 和力。為方便起見(jiàn)，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)抗體時(shí)，也考慮顯示相同特征的其片段。
[0043]對(duì)a_突觸核蛋白單體具有低結(jié)合親和力意思是抗體或片段與a_突觸核蛋白單 體的結(jié)合比與a-突觸核蛋白聚合體的結(jié)合小至少100倍，優(yōu)選地約500倍，或者，與a-突 觸核蛋白單體的結(jié)合親和力比與a-突觸核蛋白聚合體低1000倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗 體或其片段對(duì)單體a-突觸核蛋白的解離常數(shù)Kd大于10 5M。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體對(duì)a_突觸核蛋白原纖維的親和力可以高于對(duì)低聚形式 的a-突觸核蛋白的親和力。
[0045] 抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)使用本領(lǐng)域中認(rèn)可的各種方法來(lái)測(cè)定，包括等溫量熱法 和基于表面等離子體共振的方法，例如實(shí)施例6中所描述的。結(jié)合也可以使用免疫測(cè)定如 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)或放射免疫分析（RIA)來(lái)評(píng)價(jià)。優(yōu)選地，使用表面等離子體共 振分析利用BIACore?X-100測(cè)定結(jié)合親和力。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是構(gòu)象抗體（conformationalantibody)。所述抗體識(shí)別 構(gòu)象表位，即抗體所識(shí)別的表位包括a-突觸核蛋白的聚合體的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，相比表5所描述的任何線型肽的表位，抗體結(jié)合較強(qiáng)地結(jié)合a_突觸核蛋白原纖維。 具體而言，抗體與a-突觸核蛋白原纖維的結(jié)合比與表5所描述的線型肽的表位高至少100 倍，優(yōu)選500倍以上，或優(yōu)選1000倍以上。
[0047]本發(fā)明的抗體可以弱結(jié)合a-突觸核蛋白的氨基酸區(qū)127-140內(nèi)的線型表位。弱 結(jié)合的意思是本發(fā)明的抗體與a-突觸核蛋白的氨基酸區(qū)127-140內(nèi)的線型表位的結(jié)合親 和力比抗體與a-突觸核蛋白聚合體的結(jié)合親和力小至少1〇〇倍，特別是比與a-突觸核 蛋白原纖維的結(jié)合親和力小至少100倍。優(yōu)選地，與a-突觸核蛋白的氨基酸區(qū)127-140 內(nèi)的線型表位的結(jié)合親和力比抗體與a-突觸核蛋白聚合體的結(jié)合親和力小1000倍。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體不識(shí)別或不結(jié)合a-突觸核蛋白的線型表位。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，被抗體所識(shí)別的表位包含a-突觸核蛋白的C末端區(qū)。識(shí)別 包含a-突觸核蛋白的C末端區(qū)的表位的意思是所述抗體有能力結(jié)合的至少部分的表位包 括至少部分的a-突觸核蛋白的C末端區(qū)。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體也可以結(jié)合磷酸化a-突觸核蛋白的聚合形 式。相比磷酸化a-突觸核蛋白的聚合形式，所述抗體顯示與磷酸化a-突觸核蛋白的單 體形式的低結(jié)合親和力，例如抗體與磷酸化a-突觸核蛋白的單體形式的結(jié)合親和力比與 聚合的磷酸化a-突觸核蛋白的結(jié)合親和力小至少100倍，優(yōu)選小500倍，更優(yōu)選小1000 倍。a-突觸核蛋白的磷酸化可發(fā)生在Serl29。
[0050] 本發(fā)明的抗體還顯示與其它淀粉樣蛋白的低結(jié)合親和力，所述淀粉樣蛋白包括 突觸核蛋白、y-突觸核蛋白單體、IAPP(胰島淀粉樣多肽）、(6-淀粉樣蛋白單體、 Tau(濤蛋白）和ABri，例如抗體與這些肽/蛋白中的一種或多種的結(jié)合親和力比與a-突 觸核蛋白聚合體的結(jié)合親和力小至少100倍。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的a-突觸核蛋白聚合體抗體與(6-突觸核蛋白的結(jié) 合親和力比與a-突觸核蛋白聚合體的結(jié)合親和力小至少1〇〇倍，優(yōu)選小1000倍。具體而 言，所述抗體與(6-突觸核蛋白的結(jié)合親和力比與a-突觸核蛋白原纖維的結(jié)合親和力小 至少100倍，優(yōu)選小1000倍。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的a-突觸核蛋白聚合體抗體與Y-突觸核蛋白的結(jié) 合親和力比與a-突觸核蛋白聚合體的結(jié)合親和力小至少1〇〇倍，優(yōu)選小1000倍。具體而 言，所述抗體與Y-突觸核蛋白的結(jié)合親和力比與a-突觸核蛋白原纖維的結(jié)合親和力小 至少100倍，優(yōu)選小1000倍。
[0053] 本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供了在可變重（VH)鏈和可變輕（VL)鏈上包含限定的 ⑶R1-3區(qū)的氨基酸序列的抗體。
[0054] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含可變重鏈（VH)，其中所述VH包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列。