一種檢測四溴雙酚a毒性效應(yīng)的櫛孔扇貝基因芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的基因芯片，用于對四溴雙 酚A所引起的相關(guān)基因表達(dá)量變化的檢測，屬于基因芯片檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 四溴雙酸A(tetrabisphenolA)是目前世界上產(chǎn)量和使用量最大的一種溴系阻燃 劑，這種阻燃劑可以被作為反應(yīng)型阻燃劑（超過90%)添加到印刷電路板和作為添加型阻 燃劑混合入塑料合成物中。由于其廣泛使用，并能夠從產(chǎn)品中釋放到環(huán)境中，目前在全球范 圍內(nèi)的環(huán)境介質(zhì)中普遍存在。目前，TBBPA在大氣，水體，土壤，生物體內(nèi)均已被檢出。研究 表明，TBBPA是一種潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有潛在的持久性、細(xì)胞毒性、免疫毒性、甲 狀腺素干擾性以及雌激素干擾性，尤其對水生生物產(chǎn)生嚴(yán)重毒害作用。由于雙殼貝類在兩 半球分布廣泛，大多營濾食性生活，活動范圍小，能夠大量富集海洋污染物，因而被認(rèn)為是 非常合適的哨兵物種，并已被廣泛應(yīng)用于海洋環(huán)境中有毒物質(zhì)的監(jiān)測工作中。很多用于生 物監(jiān)測的貝類物種又是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)貝類，研究貝類體內(nèi)的累積特征關(guān)系到水產(chǎn)品的質(zhì) 量安全，與人類健康息息相關(guān)。因此采用基因芯片技術(shù)，研究櫛孔扇貝在四溴雙酚A脅迫下 體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量的變化，為研究該水域地區(qū)四溴雙酚A污染情況提供高效、穩(wěn)定的監(jiān) 測技術(shù)。
[0003] 常用檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的方法主要有熒光定量PCR與高通量測 序方法。熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記 跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，并且可由實(shí)驗(yàn)者結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測 樣品模板的初始濃度，但相對于高通量測序技術(shù)與基因芯片技術(shù)，熒光定量PCR檢測規(guī)模 較小，是一種不適合大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的檢測的技術(shù)。相較于熒光定量PCR技術(shù)而言，高通量測序 技術(shù)靈敏度較低且所需的儀器價格昂貴，檢測成本高，分析速度慢，無法在短時間內(nèi)準(zhǔn)確檢 測出四溴雙酚A對對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種基因芯片用于檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)， 是一種具有高靈敏性和特異性的快速檢測方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的基因芯片，其特征在于包括固相載體 和固定在該固相載體上的8種寡核苷酸探針，所述8種寡核苷酸探針取自櫛孔扇貝特定的 8個基因序列，所述的8種寡核苷酸探針是SEQIDNO. 1~8所示的核苷酸序列。
[0007] 所述固相載體選自載玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙烯。
[0008] 本發(fā)明還涉及前述檢測檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的基因芯片的使用 方法，包括以下步驟：
[0009] (a)f節(jié)孔扇貝cDNA樣品的制備；
[0010] (b)熒光標(biāo)記上述cDNA樣品；
[0011] 其特征在于還包括以下步驟：
[0012] (c)將熒光標(biāo)記后的cDNA樣品與所述基因芯片雜交；
[0013] (d)掃描檢測基因芯片的雜交信號，獲得結(jié)果。若有基因差異表達(dá)，表示該櫛孔扇 貝可能受到四溴雙酚A脅迫，繼而進(jìn)行進(jìn)一步定量檢測。
[0014] 本申請就四溴雙酚A對雙殼貝類的毒性效應(yīng)經(jīng)過多年研究之后，在原有的毒理學(xué) 研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)出的新型的基于毒理學(xué)研究技術(shù)的基因芯片及檢測方法，該方法與熒 光定量PCR與高通量測序方法相比，穩(wěn)定性更高，檢測速度更快，檢測規(guī)模更大，檢測靈敏 度及特異性更高，檢測成本更低，具有明顯的先進(jìn)性。
[0015] 本發(fā)明建立了用于檢測櫛孔扇貝在在四溴雙酚A脅迫下毒性效應(yīng)的的基因芯片 及其制造和使用方法。利用生物監(jiān)測技術(shù)，為監(jiān)測環(huán)境中四溴雙酚A殘留提供了一種快速 高效的檢測手段。
[0016] 本發(fā)明中所提供的基因芯片及檢測方法經(jīng)初步應(yīng)用于櫛孔扇貝，由于該方法采用 的是多基因芯片技術(shù)，具有高效、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可以快速、精確、特異性的檢測其 在不同濃度四溴雙酚A的脅迫下相關(guān)基因表達(dá)量的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明
[0018] 一、主要儀器：
[0019] 表1?主要儀器：
[0020]
[0021] 二、主要試劑：
[0022] 表2?主要試劑：
[0023]
[0024] 三、本發(fā)明基因芯片的制備方法的具體步驟如下：
[0025] 1、設(shè)計檢測的特異性探針：在GenBank和已知轉(zhuǎn)錄組文庫中分別選取特定的8個 基因序列，利用生物信息學(xué)軟件Primer Express 2.0設(shè)計特異性探針；
[0026] 2、將上述設(shè)計完成的探針經(jīng)合成后按設(shè)計好的陣列布局固定于固相載體尼龍膜 上即構(gòu)成本發(fā)明的基因芯片。
[0027] 四、利用上述基因芯片檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的方法，包括以下步 驟：
[0028] (a)櫛孔扇貝cDNA樣品的制備，具體如下：
[0029] 1、樣本Total RNA的提取和質(zhì)檢
[0030]采用合適的方法，比如 Trizol (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)提取組織塊 或細(xì)胞樣品中的總RNA，并進(jìn)一步進(jìn)行純化和定量分析。
[0031] 2、Total RNA 合成 cDNA
[0032] 1)反轉(zhuǎn)錄合成 First Strand cDNA
[0033] 在0. 2mL無核酸酶的離心管中依次加入以下試劑：
[0034]取 Total RNA 100_500ng，調(diào)整體積到 4yL。
[0035] 若使用晶芯?基因表達(dá)譜系列芯片，加入晶芯?基因表達(dá)譜外參（Cat. No. 360030) 1 u L，否則加入 1 u L Nuclease-free Water。
[0036] 配制反轉(zhuǎn)錄Master Mix (下列表3所示為單個反應(yīng)體系用量），輕輕混勻，短暫離 心放在冰浴上。取5yL Master Mix分別轉(zhuǎn)移至含有Total RNA樣品的0.2mL離心管中。
[0037]表 3.反轉(zhuǎn)錄 Master Mix :
[0038]
[0039] 輕輕混勻溶液，瞬時離心后42°C反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束后離心并冰浴。
[0040] 2)合成Second Strand cDNA
[0041] 配制Second Strand Master Mix (表4)，輕輕混勾，短暫離心后冰浴。在上述反應(yīng) 結(jié)束后的每個樣品管中加入20 yL Second Strand Master Mix。
[0042]表4.Second Strand Master Mix :
[0043]
[0044] 輕柔混勻，16°C反應(yīng)1小時，65°C 10min。
[0045] 反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于冰上繼續(xù)合成反應(yīng)，或者迅速凍存于_20°C。
[0046] 3、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA
[0047] cRNA 合成
[0048] 配制體外轉(zhuǎn)錄Master Mix (下列表5所示為單個反應(yīng)體系用量），輕輕混勻，短暫 離心將溶液收集于管底，向上述反應(yīng)結(jié)束的每個樣品管中加入30 y L Master Mix。
[0049]表5?體外轉(zhuǎn)錄Master Mix :
[0050]
[0051] 輕柔混