一種黑色素細胞的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種黑色素細胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]白癜風是由于皮膚和毛囊的黑色素細胞(melanocyte，MC)內酪氨酸系統(tǒng)的功能減退、喪失引起的一種以局限性或泛發(fā)性色素脫失為特征的皮膚粘膜疾病。黑色素細胞位于表皮的基底層，與表皮細胞共同組成表皮黑素單位，其主要功能是產生黑素小體保護皮膚免受損害。
[0003]白癜風患者皮損部位的黑色素細胞變化過程是由早期功能失活到晚期缺失，基于這一病理變化，有效治療的原理是將自身的黑色素細胞從健康皮膚移植到無黑色素細胞的白斑區(qū)，并在移植后成活產生黑素。這一治療原理是臨床中白癜風移植治療的依據，在移植治療中，黑色素細胞混懸液移植法為有效手段之一，治愈率達90%以上，其過程為:以非培養(yǎng)或培養(yǎng)的方式制備黑色素細胞懸液，然后將黑色素細胞懸液以700-1000/mm2密度移植到受皮區(qū)。
[0004]由于黑色素細胞僅占表皮細胞數量的I %左右，而且其生長緩慢，增殖能力極為有限，所以如何在培養(yǎng)過程中去除角質形成細胞是黑色素細胞培養(yǎng)的重點，同時黑色素細胞在培養(yǎng)過程中極易被成纖維細胞污染，有時即使混入了極少量的成纖維細胞也會導致培養(yǎng)的失敗。現有技術中，采用既能促進黑色素細胞生長又能抑制角質形成細胞TPA(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)和霍亂毒素基本上解決了上述問題。但是TPA具有潛在的促腫瘤作用，從而使上述培養(yǎng)方法在臨床上受到了限制。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和二丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)作為添加劑替代TPA進行原代培養(yǎng)則解決了上述技術問題，該技術可以使促進黑色素細胞生長，并且規(guī)避了 TPA具有潛在的促腫瘤的風險。一旦發(fā)生了成纖維細胞的混雜，一般情況下采用加入G418等有絲分裂細胞抑制劑、降低鈣離子濃度或機械刮除等方法以去除成纖維細胞，但是大多數方法不僅達不到完全除去成纖維細胞的效果，更在抑制成纖維細胞的同時也影響了黑色素細胞的生長。
[0005]利用上述方法培養(yǎng)的黑色素細胞，占表皮細胞的比例不高，總數有限，分化活性不高，不能滿足臨床需要。

【發(fā)明內容】

[0006]為了解決現有技術黑色素細胞培養(yǎng)中黑色素細胞的比例和總數不高，增殖和分化活性低的問題，提供一種可以產生高比例、高分化活性的黑色素細胞的培養(yǎng)方法。
[0007]為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案如下:
[0008]—種黑色素細胞的培養(yǎng)方法，包括在黑色素細胞增殖培養(yǎng)之前先進行預培養(yǎng)2_4h，所述預培養(yǎng)基為:
[0009]DMEM培養(yǎng)基與Ham’s F_12培養(yǎng)基按體積比2_4:1混合；
[0010]腺嘌呤1.6-2.0X10 4M ；[0011 ]青霉素 80-100 單位 /mL ；
[0012]鏈霉素80-120 μ g/mL ；
[0013]氫化可的松0.1-0.5 μ g/mL ；
[0014]胰島素2-6 μ g/mL;
[0015]表皮生長因子5_12ng/mL ；
[0016]霍亂毒素0.8-1.5X10 10M ;
[0017]胎牛血清4-7 % (體積濃度)。
[0018]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法，優(yōu)選的，所述預培養(yǎng)基為:DMEM培養(yǎng)基與Ham’sF-12培養(yǎng)基按體積比3:1混合；
[0019]腺嘌呤1.8X10 4M ；
[0020]青霉素100單位/mL ；
[0021]鏈霉素100 μ g/mL;
[0022]氫化可的松0.4 μ g/mL ；
[0023]胰島素5 μ g/mL;
[0024]表皮生長因子10ng/mL ；
[0025]霍亂毒素1.2X10 10M ;
[0026]胎牛血清5% (體積濃度)。
[0027]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法中，在預培養(yǎng)之前還包括:將離體的表皮用分解混合酶進行消化培養(yǎng)0.5-2小時，終止消化后，過濾、離心，然后接種預培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)；所述分解混合酶為胰蛋白酶或和I型膠原酶。
[0028]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法中，預培養(yǎng)的接種密度為2-10X 14個細胞/cm2。
[0029]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法中，將預培養(yǎng)后的黑色素細胞轉移到增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)。
[0030]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法中，預培養(yǎng)后，去掉預培養(yǎng)基，然后將貼壁后的細胞轉移到增殖培養(yǎng)基，所述增殖培養(yǎng)基為M2培養(yǎng)基。
[0031]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法中，所述增殖培養(yǎng)的方法為:每周換液3次，當細胞達到70-80%飽和后，對黑色素細胞進行消化，回收，重懸，播種進行擴增傳代。
[0032]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法中，對黑色素細胞進行消化的方法為:將lg/L胰蛋白酶.0.152g/L EDTA溶液加入到培養(yǎng)基中，孵育3_5min，終止消化。
[0033]上述黑色素細胞的培養(yǎng)方法中，所述播種的密度為5-10X 13個細胞/cm2。
[0034]—種黑色素細胞懸液制劑的制備方法，將利用上培養(yǎng)方法培養(yǎng)傳代3-4代后的黑色素細胞消化、離心，用黑色素細胞懸液重懸細胞，制備黑色素細胞懸液制劑。
[0035]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0036]1、本發(fā)明的黑色素細胞的培養(yǎng)方法，在黑色素細胞增殖培養(yǎng)之前進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)基中的血清成分，可迅速改善分解酶處理過程中對細胞造成的損傷；在預培養(yǎng)基中DMEM培養(yǎng)基和Ham’s F-12培養(yǎng)基、FBS以及其他組分相互作用下，促進黑色素細胞優(yōu)先于表皮細胞貼壁；在2-4小時內，即可以達到有效數目的黑色素細胞的貼壁；同時實現了對于表皮細胞的優(yōu)選，活性好、貼壁性能保持良好的角質形成細胞優(yōu)先貼壁，分化了的增殖性低的角質形成細胞以及受損嚴重的角質形成細胞不貼壁。同時通過預培養(yǎng)，提早除去貼壁不良或者不能貼壁的細胞，有效提高了培養(yǎng)基成分的有效利用。預培養(yǎng)為后續(xù)表皮細胞形成活性高的克隆并通過旁分泌更快地促進黑色素細胞的增殖以及維持其在良好的分化狀態(tài)和細胞功能以及穩(wěn)定的遺傳性狀提供了基礎。
[0037]2、本發(fā)明的黑色素細胞的培養(yǎng)方法，用了胰蛋白酶和I型膠原酶的分解混合酶代替了原來的單一分解酶，低濃度的胰蛋白酶與I型膠原酶配合，在保證細胞消化均勻的前提下，減少了對細胞損傷，保證了細胞的良好狀態(tài)。
[0038]3、本發(fā)明的黑色素細胞的培養(yǎng)方法，傳代時，嚴格控制胰蛋白酶的加入量和處理時間，使黑色素細胞會優(yōu)先于表皮細胞被胰蛋白酶處理下來的，以此來提高黑色素細胞濃度和比例。由此，通過原代培養(yǎng)時候的預培養(yǎng)和控制傳代時的胰蛋白酶處理時間，維持少量的表皮細胞的增生活性，而良好的表皮細胞增生會通過旁分泌的形式促進黑色素細胞增生并維持分化活性，從而減少了黑色素細胞有脫分化。
[0039]4、本發(fā)明的黑色素細胞的培養(yǎng)方法，經過3-4代后，培養(yǎng)的黑色素細胞總數就能擴增到5-10X 16細胞數/mL，黑色素細胞與表皮細胞的比例從最初的黑色素細胞占1%，通過培養(yǎng)，提高到了 80-90%，并且培養(yǎng)的黑色素細胞形態(tài)和功能及遺傳性狀穩(wěn)定，滿足臨床需要。
[0040]5、本發(fā)明的黑色素細胞懸液制劑的制備方法，黑色素細胞懸液制劑中黑色素細胞數量和比例高、增殖和分化活性高，不使用TPA或G-418安全性高，以供患者再次需要時使用。
【附圖說明】
[0041]圖1為黑色素細胞增殖培養(yǎng)第三天的狀態(tài)(20倍物鏡)。
[0042]圖2為黑色素細胞增殖培養(yǎng)第七天的狀態(tài)(10倍物鏡)。
[0043]圖3為培養(yǎng)的黑色素細胞(4倍物鏡)。
[0044]圖4為培養(yǎng)的黑色素細胞(10倍物鏡)。
[0045]圖5為培養(yǎng)的黑色素細胞(20倍物鏡)。
[0046]圖6為多巴染色的黑色素細胞(10倍物鏡)。
[0047]圖7為多巴染色的黑色素細胞(20倍物鏡)。
[0048]圖8為多巴染色的黑色素細胞(40倍物鏡)。
[0049]圖9為無預培養(yǎng)的黑色素細胞培養(yǎng)第三天的狀態(tài)(20倍物鏡)。
[0050]圖10為無預培養(yǎng)的黑色素細胞培養(yǎng)第七天的狀態(tài)(10倍物鏡)。
【具體實施方式】
[0051]下面將通過附圖和具體實例對本發(fā)明作進一步說明。
[0052]實施例1
[0053]將20mL DMEM培養(yǎng)基和青霉素、鏈霉素(青霉素100單位/mL ;鏈霉素100 μ g/mL)加入50mL離心管，作為皮膚吸泡保存液。
[0054]將lmL、10g/L的I型膠原酶加入Φ60πιπι培養(yǎng)皿，備用。將離體的表皮(吸泡取皮方式獲取，8-15個吸泡)放入上述培養(yǎng)皿中，并用眼科剪將表皮剪碎成2_Χ2_的碎片。
[0055]剪碎后向培養(yǎng)皿中補加為lmL、2.5g/L胰蛋白酶.0.38g/L EDTA溶液，放入37°C培養(yǎng)箱中，I個小時。
[0056]每隔半小時，取出培養(yǎng)皿在顯微鏡下觀察消化的狀況。Ih后將培養(yǎng)皿取出吹打皮膚碎片，顯微鏡下觀察，如果發(fā)現表皮上細胞基本消化完全，即加入預培養(yǎng)基終止消化。
[0057]將消化的皮片和懸浮液回收到15mL離心管中，用細胞濾網過濾，并離心，的離心后的細胞。
[0058]用5-15mL的預培養(yǎng)基重懸，吹打均勻后接種到1_3個Φ60πιπι培養(yǎng)皿，播種密度設為4 X 14個細胞/cm 2，放入培養(yǎng)箱中。
[0059]預培養(yǎng)基組成為:DMEM培養(yǎng)基與Ham’s F-12培養(yǎng)基按體積比3:1混合；腺嘌呤1.8X10 4M ;青霉素100單位/ml ;鏈霉素100 μ g/ml ;氫化可的松0.4 μ g/ml ;胰島素5 μ g/ml ;表皮生長因子10ng/ml ;霍亂毒素1.2X10 10M;胎牛血清5%。
[0060]2個小時后，觀察細胞貼壁的情況，去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入5mL M2培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)。
[0061]在進行增殖培養(yǎng)后的第二天會發(fā)現貼壁的表皮細胞狀態(tài)好，克隆狀態(tài)好，播種的第三天即可以發(fā)現在表皮細胞克隆周邊有黑色素細胞分裂像，如圖1所示。播種后第七天可見表皮細胞克隆間隙中的大量的黑色素細胞克隆，黑色素細胞生長增殖快，分化狀態(tài)好，如圖2所示。
[0062]每周換液3次，當細胞達到70%飽和后，對細胞進行消化，回收，重懸，播種進行擴增傳代。
[0063]消化的步驟:用PBS清洗，加入lg/L胰蛋白酶.0.152g/L EDTA溶液，3分鐘后常溫消化，顯微鏡下觀察到黑色素細胞已經從培養(yǎng)皿上剝離，即終止消化，回收細胞，重懸接種，接種密度為5 X 13個細胞/cm 2o
[0064]上述消化的步驟可以優(yōu)先將黑色素細胞消化下來。
[0065]3周內，傳代到3代。此時培養(yǎng)中的黑色素細胞具有良好的增殖活性和分化活性，細胞數目可以達到0.7 X 17細胞數/mL，黑色素細胞占80 %，黑色素細胞呈網絡狀克隆樣增殖，形態(tài)上細胞體小，呈現兩個以上分枝，黑色素細胞的分枝可以彼此相連，也可以伸長到周邊的表皮細胞，見圖3-5。將細胞進行多巴染色，黑色素細胞呈現陽染。
[0066]細胞傳至4代時，此時培養(yǎng)中的黑色素細胞具有良好的增殖活性和分化活性，細胞數目可以達到I X 17細胞數/mL，黑色素細胞占90%。用移液管吸取DPBS加到培養(yǎng)皿中，清洗培養(yǎng)皿。每個O60mm中加入ImL lg/L胰蛋白酶.0.152g/L EDTA溶液，室溫下孵育3-5min，顯微鏡下確認黑色素細胞完全脫落后，