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一種固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法_3

文檔序號(hào):9390785閱讀:來(lái)源:國(guó)知局
,流動(dòng)相為0. 1%TFA/水-0. 1%TFA/乙腈體系,上樣量為 6. 0g/次,流速300ml/min,梯度洗脫;峰前和峰后循環(huán)進(jìn)樣,截取中控分析純度為99. 5%以 上,單雜小于0. 1%的精肽溶液,濃縮后凍干得精肽25. 7g,純化收率為57. 1%,純度99. 6%,單 雜均小于0. 1%。
[0028] 實(shí)施例10:利拉魯肽的制備 將實(shí)施例8所得精肽56. 0g(15mm〇l)加入2L三口反應(yīng)瓶中,加入1000ml10%乙腈水 溶液攪拌溶解,冰水浴下,緩慢滴加10%Na2C03水溶液,調(diào)節(jié)溶液pH至11,停止滴加;在冰 水浴下滴加Pal-OSu的THF溶液7.lg(30mmol)/150ml,滴加完畢,撤冰浴,室溫下反應(yīng)3h; 加入2. 25g(30mmol)甘氨酸,繼續(xù)反應(yīng)30min,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn); 向反應(yīng)液中激烈攪拌下加入150ml哌啶,室溫下繼續(xù)攪拌,HPLC監(jiān)測(cè)堿解終點(diǎn);反應(yīng) 到終點(diǎn)后,停止攪拌,G3砂芯漏斗濾除不溶物,并用純凈水洗滌不溶物三次;合并洗液和濾 液,用超濾裝置除鹽,不斷加入純水稀釋肽溶液,保持溶液體積不變;當(dāng)溶液pH值降至11 時(shí),采用0. 5%醋酸水溶液稀釋肽溶液,至pH值降至5時(shí),停止抽濾。濾液經(jīng)0. 45um濾膜過(guò) 濾,待用。
[0029] 內(nèi)徑為100mmC8制備柱,流動(dòng)相為20mM醋酸銨水溶液-乙腈體系,上樣量為 3. 0g/次,流速300ml/min,梯度洗脫;峰前和峰后循環(huán)進(jìn)樣,截取中控分析純度為99. 5%以 上,單雜小于0. 1%的精肽溶液,脫鹽后濃縮凍干得精肽39. 3g,收率為70. 2%,純度99. 6%,單 雜均小于0. 1% ;制備總收率為37. 5%。
[0030] 實(shí)施例11:利拉魯肽的制備 將實(shí)施例9所得精肽24. 3g(6. 5mmol)加入1L三口反應(yīng)瓶中,加入500ml10%乙腈水 溶液攪拌溶解,冰水浴下,緩慢滴加10%H3PA/NMP溶液,調(diào)節(jié)溶液pH至11,停止滴加;在冰 水浴下滴加Pal-OSu的THF溶液4. 6g(13mmol)/80ml,滴加完畢,撤冰浴,室溫下反應(yīng)3h; 加入0. 98g(13mmol)甘氨酸,繼續(xù)反應(yīng)30min,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn); 向反應(yīng)液中激烈攪拌下加入61ml哌啶,室溫下繼續(xù)攪拌,HPLC監(jiān)測(cè)堿解終點(diǎn);反應(yīng) 到終點(diǎn)后,停止攪拌,G3砂芯漏斗濾除不溶物,并用純凈水洗滌不溶物三次;合并洗液和濾 液,用超濾裝置除鹽,不斷加入純水稀釋肽溶液,保持溶液體積不變;當(dāng)溶液pH值降至11 時(shí),采用0. 5%醋酸水溶液稀釋肽溶液,至pH值降至5時(shí),停止抽濾。濾液經(jīng)0. 45um濾膜過(guò) 濾,待用。
[0031] 內(nèi)徑為100mmC8制備柱,流動(dòng)相為20mM醋酸銨水溶液-乙腈體系,上樣量為 3. 0g/次,流速300ml/min,梯度洗脫;峰前和峰后循環(huán)進(jìn)樣,截取中控分析純度為99. 5%以 上,單雜小于0. 1%的精肽溶液,脫鹽后濃縮凍干得精肽17. 3g,收率為71. 1%,純度99. 6%,單 雜均小于0. 1% ;制備總收率為34. 5%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,包括如下步驟: (a) Boc-Glu (OSu)-OtBu和Fmoc-Lys-OH在喊性溶液下偶聯(lián)生成二肽單體Fmoc-Lys (N-e- (Y-Glu(N-a -Boc)-OtBu)-OH ; (b) 以Wang樹脂或CTC樹脂為固相載體,采用Fmoc化學(xué)保護(hù)策略,按照利拉魯肽肽序, 依次與Fmoc保護(hù)氨基酸合成N端三氟乙?;娜Wo(hù)肽樹脂,其中Fmoc保護(hù)氨基酸26位 Lys 采用的是單體 Fmoc-Lys (N- e - ( y -Glu (N- a -Boc) -OtBu) -OH,24 位和 25 位采用二肽單 體Fmoc-Ala-Ala-OH ;N端三氟乙酰化的全保護(hù)肽樹脂結(jié)構(gòu)如下: Tfa-His (Trt)-Ala-Glu (OtBu)-Gly-Thr (tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)- Ser (tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-e-(Y-Glu(N-a -Boc) -OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-A rg (Pbf)- Gly-樹脂; (c) 用裂解試劑裂解肽樹脂得到三氟乙?;睦旊模ㄎ葱揎棧?,并經(jīng)純化,得到 精肽:Tfa-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln -Ala- Ala -Lys(Y-Glu - OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg- Gly-OH ; (d) 在堿性條件下,Pal- OSu與步驟(c)所得三氟乙?;睦旊模ㄎ葱揎棧┚?發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng),得到棕櫚酸修飾的產(chǎn)物; (e) 經(jīng)堿解、純化、凍干得到利拉魯肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,步驟(a)中制備 二肽單體Fmoc-Lys (N- e _(y-Glu (N-a -Boc)-OtBu)-OH 的具體操作為:將Fmoc-Lys-OH與 堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%體積的有機(jī)溶劑B助溶,待完 全溶解后,攪拌下滴加入1~1.2倍摩爾量(以Fmoc-Lys-OH的量計(jì))Boc-Glu (OSu) -OtBu 的有機(jī)溶劑B溶液;繼續(xù)攪拌反應(yīng),TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn),反應(yīng)結(jié)束后,減壓蒸掉有機(jī)溶劑,加 入10%檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Lys (N- e - ( y -Gl u(N_ a -Boc) _0tBu)_0H。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,步驟(b)中N 端三氟乙酰化的全保護(hù)肽樹脂的具體制備方法為:以Wang樹脂或CTC樹脂為固相載體,以 2-5倍的投料比(以合成規(guī)模的物質(zhì)量計(jì)),加入相應(yīng)的Fmoc保護(hù)氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng),每 一個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)均是在縮合劑的存在下進(jìn)行的固相接肽反應(yīng),反應(yīng)完畢后用脫保護(hù)試劑脫除 Fmoc,再與下一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng);重復(fù)操作直至合成至1位His后,用三 氟乙酸酐封端,得到N端三氟乙?;娜Wo(hù)肽樹脂Tfa-His(Trt)- Ala-Glu(OtBu)-Gly -Thr(tBu)-Phe- Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu -Glu (OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala- Lys (N- e- (y-Glu(N- a -Boc)-OtBu) -Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Gly-Arg (Pbf) -Gly-樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,Wang樹脂或CTC 樹脂的替代度為0. 3-0. 5mmol/g。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,26位Lys采用 的 Fmoc 保護(hù)氨基酸為 Fmoc-Lys (N- e - ( y -Glu (N- a -Boc) -OtBu) -OH,24 位和 25 位 Ala 米 用Fmoc保護(hù)氨基酸為二肽單體Fmoc-Ala-Ala-OH ;其他位點(diǎn)均采用常規(guī)的Fmoc保護(hù)氨基 酸偶聯(lián)。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,所述縮合劑為 DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/ HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA 的一種;脫 保護(hù)試劑為15~25% (體積含量)哌啶/DMF溶液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,步驟(c)中所述裂 解試劑為加入體積比1-5%清除劑的TFA溶液,所述清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、 巰基乙醇、苯酚、水、三異丙基硅烷中的一種或幾種。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,步驟(d)的具體 操作步驟為:取步驟(c)所得精肽與堿A按照摩爾比1:4~6的比例溶解在水中,加入體積 比5~20%的有機(jī)溶劑B助溶,待完全溶解后,攪拌下滴加入1~2. O倍摩爾量(以精肽的 量計(jì))Pal-OSu的有機(jī)溶劑B溶液;繼續(xù)攪拌反應(yīng),TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn);反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)后,加 入1~2. 0倍摩爾量的甘氨酸(以精肽的量計(jì)),終止反應(yīng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求2或8任一項(xiàng)所述的固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于:所 述堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、三乙胺、二乙胺、N-乙基二異丙基胺、N,N-二 異丙基乙胺等中的一種或幾種;所述有機(jī)溶劑B為四氫呋喃、二氧六環(huán)、N,N-二甲基甲酰 胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一種或一種以上的混合液。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固液結(jié)合制備利拉魯肽的方法,其特征在于,步驟(e)中堿 解的具體操作步驟為:量取體積比10-12%的哌啶(以步驟(d)所得的溶液體積計(jì)),加入步 驟(d)所得的溶液中,配制成濃度為IM的哌啶溶液,攪拌反應(yīng)至三氟乙?;鶋A解完全;然后 經(jīng)超濾裝置脫鹽,不斷加入純水稀釋肽溶液,保持溶液體積不變;當(dāng)溶液PH值降至12~10 時(shí),采用0. 2-1. 0%醋酸水溶液稀釋肽溶液,至pH值降至5~6時(shí),停止抽濾。
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域,特別涉及一種采用固液相結(jié)合的化學(xué)方法制備利拉魯肽的方法,本發(fā)明能夠簡(jiǎn)化利拉魯肽的制備工藝,提高終產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);本發(fā)明首次合成二肽單體Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-Boc)-OtBu)-OH,并將其用于利拉魯肽的制備,同時(shí)采用Fmoc-Ala-Ala-OH參與制備利拉魯肽,避免了24位或25位缺失Ala雜質(zhì)肽的生成,降低了純化難度,提高了收率;三氟乙?;睦旊?未修飾)水溶性較好,利于反相色譜純化制備,同時(shí)還保護(hù)了N端的氨基在棕櫚酸修飾過(guò)程中不發(fā)生副反應(yīng),極大地提高了終產(chǎn)品的收率;本發(fā)明的實(shí)施,解決了化學(xué)合成利拉魯肽過(guò)程中終產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)肽超標(biāo)、總收率低的難題,得到純度大于99.5%,單雜小于0.1%的終產(chǎn)品,降低了生產(chǎn)成本。
【IPC分類】C07K14/605, C07K1/06, C07K1/04
【公開號(hào)】CN105111303
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510347921
【發(fā)明人】張穎, 李同金, 王仁友, 石鑫磊, 南勤坤
【申請(qǐng)人】濟(jì)南康和醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月23日
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