固定化轉(zhuǎn)氨酶和制備及使用固定化轉(zhuǎn)氨酶的方法
【專利說明】固定化轉(zhuǎn)氨酶和制備及使用固定化轉(zhuǎn)氨酶的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及固定化轉(zhuǎn)氨酶和生產(chǎn)及使用它們的方法。
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[0003] 發(fā)明背景 酶是用于加速活細胞的化學反應（通常為幾個數(shù)量級）的蛋白分子。在沒有酶的情況 下，大部分生化反應將非常緩慢以致于甚至無法進行生命過程。酶展示出巨大的特異性，并 且不會由它們在反應中的參與而被持久地修飾。由于它們在反應中并不改變，因此可以成 本有效地將酶作為催化劑用于期望的化學轉(zhuǎn)化。
[0004] 轉(zhuǎn)氨酶是催化酮類至手性胺的直接氨基化的特異類型的酶。對映體純手性胺在合 成具有廣泛生物活性的許多藥物化合物中是關(guān)鍵中間體。目前在進行許多努力以利用生物 催化劑開發(fā)用于它們制備的有效催化方法。近期，轉(zhuǎn)氨酶已經(jīng)顯現(xiàn)出作為用于手性胺生產(chǎn)
[0005]例如，銠催化的不對稱烯胺氫化最初用于大規(guī)模制造抗糖尿病的化合物 西他列汀。用轉(zhuǎn)氨酶代替銠，這最終已經(jīng)產(chǎn)生了減少廢料、改善收率和安全性并 消除對金屬催化劑的需要的酶促方法。此外，由此產(chǎn)生的生物催化劑顯示出對手 性胺合成的廣泛適用性，而所述手性胺之前其僅可通過拆分（resolution)獲得。
[0006] 盡管使用轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生手性胺的進展已經(jīng)被高度關(guān)注，但對于酶促方法仍存在某些 缺點。目前，酶促方法僅能在含水溶劑體系中進行，這是由于轉(zhuǎn)氨酶在100%的有機溶劑中 不穩(wěn)定。此外，在產(chǎn)品胺分離的過程中，轉(zhuǎn)氨酶催化劑失活并被丟棄，導致無法再次使用該 催化劑。
[0007] 因此，盡管已經(jīng)進行了嘗試以將轉(zhuǎn)氨酶固定化，但從未成功地克服它們?nèi)狈Ψ€(wěn)定 性的缺點，更具體地，它們在有機溶劑中缺乏穩(wěn)定性的缺點。
[0008] 發(fā)明概述 本文描述了固定化轉(zhuǎn)氨酶，其包含與樹脂物理連接的重組轉(zhuǎn)氨酶。本文描述的固 定化轉(zhuǎn)氨酶包括重組轉(zhuǎn)氨酶，其能夠在氨基供體存在的情況下，將4-氧代_4-[3-(三 氟甲基）-5,6_二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8功-基]-1-(2,4,5-三氟苯基） 丁-2-酮轉(zhuǎn)化成（2功-4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7(8功-基]_1_(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺至通過分析技術(shù)可測定的水平。在某些實 施方案中，使用本文描述的固定化轉(zhuǎn)氨酶以生產(chǎn)（2功-4-氧代-4- [3-(三氟甲基）-5, 6-二 氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]_1_(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺。
[0009] 在某些實施方案中，本文描述了固定化轉(zhuǎn)氨酶，其包含能夠在氨基供體存 在的情況下，將4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮轉(zhuǎn)化成（2功-4-氧代-4- [3-(三氟甲 基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺 至通過分析技術(shù)可測定的水平的重組轉(zhuǎn)氨酶；和樹脂，其中所述重組轉(zhuǎn)氨酶通過物理作用 與樹脂連接，并且其中固定化轉(zhuǎn)氨酶在包含至少90%的有機溶劑的溶劑體系中是穩(wěn)定的。
[0010] 例如，在一個實施方案中，所述重組轉(zhuǎn)氨酶通過親水作用與樹脂連接。
[0011] 本文描述的固定化轉(zhuǎn)氨酶在有機溶劑體系中是穩(wěn)定的。如本文所用，穩(wěn)定的固定 化轉(zhuǎn)氨酶表示所述固定化轉(zhuǎn)氨酶在有機溶劑體系中保持它的結(jié)構(gòu)構(gòu)象或它的活性。在本文 描述的一個實施方案中，所述固定化轉(zhuǎn)氨酶在包含至少95%的有機溶劑的溶劑體系中是穩(wěn) 定的。
[0012] 在本文描述的某些實施方案中，所述重組轉(zhuǎn)氨酶是能夠在氨基供體存在 的情況下，將4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮轉(zhuǎn)化成（2功-4-氧代-4- [3-(三氟甲 基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺 至通過HPLC-UV吸光度可測定的水平的轉(zhuǎn)氨酶。
[0013] 在仍另一個實施方案中，所述重組轉(zhuǎn)氨酶選自：SEQ IDN0: 1。
[0014] 在本文描述的固定化轉(zhuǎn)氨酶的某些實施方案中，所述樹脂包含甲基丙烯酸酯。例 如，在一種實施方案中，所述樹脂從甲基丙烯酸酯合成，其中單體和交聯(lián)劑為甲基丙烯酸 酯。在某些實施方案中，所述樹脂不含任何芳族化合物。在其他實施方案中，所述樹脂為 DIAI0NHP2MG (Mistubishi)。DIAI0NHP2MG為僅從甲基丙烯酸酯合成的高度多孔的甲基 丙烯酸酯基吸附樹脂(單體和交聯(lián)劑為甲基丙烯酸酯)。DIAION HP2MG (Mistubishi)不含 任何芳族化合物，并被認為是中度極性吸附樹脂。DIAION HP2MG (Mistubishi)適合通過使 用聚合物基質(zhì)的更親水特性進行的具有相對高極性的有機化合物的脫鹽和吸附。
[0015] 在一種實施方案中，在固定化轉(zhuǎn)氨酶中，轉(zhuǎn)氨酶SEQ ID NO: 1與樹脂DIAION HP2MG(Mitsubishi)連接。在另一種實施方案中，轉(zhuǎn)氨酶SEQ ID NO: 1通過親水作用與樹 脂 DIAION HP2MG(Mitsubishi)連接。
[0016] 本文還描述了生產(chǎn)和使用固定化轉(zhuǎn)氨酶的方法。本文描述的固定化轉(zhuǎn)氨酶可以用 于分批反應中，其中固定化轉(zhuǎn)氨酶可以在反應完成后濾出并在其他反應中再次使用?；蛘?， 本文描述的固定化轉(zhuǎn)氨酶可以用于連續(xù)反應系統(tǒng)中，其中起始物質(zhì)連續(xù)經(jīng)過所述固定化轉(zhuǎn) 氨酶并收集產(chǎn)物。
[0017] 在一個實施方案中，本文描述的方法是生產(chǎn)（2功-4-氧代_4-[3-(三氟甲 基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺 的方法，其包括以下步驟： 1) 將4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮溶于有機溶劑中； 2) 將4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮與固定化轉(zhuǎn)氨酶接觸，所述固定化轉(zhuǎn)氨酶能 夠在氨基存在的情況下，將4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a] 吡嗪-7(8功-基]-1-(2,4,5-三氟苯基）丁-2-酮轉(zhuǎn)化成（2功-4-氧代-4-[3-(三氟甲 基）_5,6_二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-1-(2,4,5-三氟苯基）丁-2-胺。
[0018] 優(yōu)選地，在此類方法中，所述固定化轉(zhuǎn)氨酶是與樹脂DIAION(Mitsubishi)物理連 接的轉(zhuǎn)氨酶SEQ IDN0: 1。
[0019] 本文還描述了生產(chǎn)固定化轉(zhuǎn)氨酶的方法，其包括： 1) 將轉(zhuǎn)氨酶溶液與樹脂和酶溶液孵育以形成固定化轉(zhuǎn)氨酶； 2) 過濾并沖洗所述固定化轉(zhuǎn)氨酶； 3) 干燥所述固定化轉(zhuǎn)氨酶。
[0020] 發(fā)明詳述 "轉(zhuǎn)氨酶（Transaminase) "，也稱為"氨基轉(zhuǎn)移酶（aminotransferase) "，在本文中用于 指具有從伯胺（3)向受體羰基化合物（2)轉(zhuǎn)移氨基（NH2)和氫原子、將胺供體轉(zhuǎn)化為它對 應的羰基化合物（4)并將受體轉(zhuǎn)化為它對應的伯胺（1)的酶促能力的多肽：
[0021] 關(guān)于本文描述的固定化轉(zhuǎn)氨酶，該轉(zhuǎn)氨酶多肽能夠在式（3)的氨基供體存在 的情況下，將式（2a)的底物4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5,6_二氫[1，2,4]三唑并 [4,3-<3]吡嗪-7(8功-基]-1-(2,4,5-三氟苯基）丁-2-酮（"酮酰胺底物"）轉(zhuǎn)化成 式（la)的產(chǎn)物（2功-4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]_1_(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺（"產(chǎn)物"），如下：
其中當獨立地獲得時，R1、R2、R3和R 4的每一個是未取代的或取代有一個或多個對酶無 抑制性的基團的烷基、烷基芳基或芳基。R1和R3在結(jié)構(gòu)或手性上可以分別與R2和R 4相同 或不同。基團R1和R2或R3和R 4-同可以形成未取代的、取代的或與其他環(huán)稠合的環(huán)。
[0022] "蛋白"、"多肽"和"肽"在本文中可以互換使用來表示通過酰胺鍵共價連接的至少 兩個氨基酸的聚合物，而與長度或翻譯后修飾（例如糖基化、磷酸化、脂化、十四烷基化、泛 素化等）無關(guān)。包括在該定義內(nèi)的有D-和L-氨基酸、和D-和L-氨基酸的混合物。
[0023] 如本文所用"底物"指在由轉(zhuǎn)氨酶介導的反應中從氨基供體接受氨基的氨基受 體，諸如酮。如本文進一步描述，底物可以包括式（II)的化合物、式（2)的化合物和式 (2a)的化合物。在本文描述的某些方法中，"酮酰胺底物"具體指式（2a)的化合物4-氧 代 _4-[3-(三氟甲基）-5,6_二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-1-(2,4,5-三 氟苯基）丁 -2-酮。
[0024] "氨基供體"指能夠向受體羰基化合物（即氨基受體）供應氨基，由此形成羰基副 產(chǎn)物的氨基化合物。氨基供體為通式（3)的分子，
其中當獨立地獲得時，R\R2的每一個是未取代的或取代有一個或多個對酶無抑制性的 基團的烷基、烷基芳基或芳基。R1在結(jié)構(gòu)或手性上可以與R2相同或不同?；鶊FR1和R 2- 同可以形成未取代的、取代的或與其他環(huán)稠合的環(huán)?？梢杂糜诒景l(fā)明的典型氨基供體包括 手性的和非手性的氨基酸、和手性的和非手性的胺。
[0025] "手性胺"指其中札和R2是不相同的通式R「01(順2) -R2的胺，并且在本文中以其 最廣泛含義使用，包括很多種不同的，和混合的功能類型的脂肪族和脂環(huán)族化合物，其特征 在于存在與仲碳原子結(jié)合的伯氨基，其除了氫原子之外還攜帶（i)形成手性環(huán)結(jié)構(gòu)的二價 基團，或（ii)兩個在結(jié)構(gòu)或手性上彼此不同的取代基（不是氫）。形成手性環(huán)結(jié)構(gòu)的二價 基團包括例如2_甲基丁燒-1，4_二基、戊燒-1，4_二基、己燒-1，4_二基、己燒-1，5_二 基、2-甲基戊烷-1，5-二基。仲碳原子上的兩個不同取代基（上文的&和1? 2)也可以在很 大程度上變化，并且包括烷基、芳烷基、芳基、鹵素、羥基、低級烷基、低級烷氧基、低級烷基 硫基、環(huán)烷基、羧基、烷氧羰基、氨基甲?；?、單-和雙-(低級烷基）取代的氨基甲酰基、三 氟甲基、苯基、硝基、氨基、單-和雙-(低級烷基）取代的氨基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、烷 基酰胺基、芳基酰胺基等，以及由上述基團取代的烷基、芳烷基或芳基。
[0026] "羰基副產(chǎn)物"指當在氨基交換反應中氨基供體上的氨基轉(zhuǎn)移至氨基受體時從氨 基供體形成的羰基化合物。羰基副產(chǎn)物具有式（4)的通常結(jié)構(gòu)：
其中&和R2的定義在對氨基供體的上文中。
[0027] "磷酸吡哆醛"、"PLP"、"5' -磷酸吡哆醛"、"PYP"和"P5P"在本文中可互換使用來 指在轉(zhuǎn)氨酶反應中充當輔酶的化合物。在某些實施方案中，通過結(jié)構(gòu)1_(4' -甲?；?3' -羥 基-2' -甲基-5' -吡啶基）甲氧基磷酸，CAS號[54-47-7]，來定義磷酸吡哆醛。5' -磷酸 吡哆醛在體內(nèi)通過吡哆醇（也被稱為吡哆素或維生素B6)的磷酸化和氧化來產(chǎn)生。在使用 轉(zhuǎn)氨酶酶類的氨基交換反應中，氨基供體的氨基轉(zhuǎn)移至輔酶以產(chǎn)生酮副產(chǎn)物，同時5'-磷 酸吡哆醛轉(zhuǎn)化為磷酸吡哆胺。通過與不同的酮化合物（氨基受體）反應再生5'-磷酸吡哆 醛。氨基從磷酸吡哆胺向氨基受體的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生手性胺并且再生輔酶。本發(fā)明的5'-磷酸吡 哆醛可以由維生素B6家族的其他成員替代，其中，包括吡哆醛（PL)、吡哆胺（PM)、及它們磷 酸化的對應物；磷酸吡哆素（PNP)和磷酸吡哆胺（PMP)。
[0028] "天然存在的"或"野生型"指自然界中發(fā)現(xiàn)的形式。例如，天然存在的或野生型多 肽或多核苷酸序列是存在于可以從自然界中的來源分離的生物體內(nèi)的序