一種新型重組鳉魚腸激酶輕鏈蛋白質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種新型重組鏘魚腸激酶輕鏈(medaka ENteropeptidase light chain, mEPL)。
【背景技術(shù)】
[0002]外源蛋白的表達(dá)方式可分為直接表達(dá)和融合表達(dá)兩種，其中利用融合表達(dá)方式往往能實(shí)現(xiàn)外源目的蛋白的高效表達(dá)，且利于分離純化。但有時目的蛋白不能以融合蛋白的形式被使用，因此需要在目的蛋白和標(biāo)簽蛋白之間設(shè)計(jì)特異的蛋白酶酶切位點(diǎn)，利用獨(dú)特的蛋白酶切割，才能得到完整的目的蛋白。目前常見的工具蛋白酶有腸激酶，Xa因子或凝血酶等，其中腸激酶由于其能完全去除目的蛋白的N端序列,而最常被使用。(Gasparian, M.et al.Express1n, purificat1n, and characterizat1n of human enteropeptidasecatalytic subunit in Escherichia col1.Protein Expr Purif.2003， 31(1)，133-9)0
[0003]腸激酶(Enteropeptidase，EP或 ENterokinase，EK, EC3.4.21.9)是存在于脊椎動物十二指腸內(nèi)的一種異源二聚體(heterodimeric)絲氨酸蛋白酶。分子量為150KDa，由I條115kDa的重鏈和I條35kDa的輕鏈組成，在pH值4.5-9.5，溫度4_45°C范圍內(nèi)特異性水角軍蛋白底物(LaVallie，E.R..et al.Cloning and funct1nal express1n of acDNA encoding the catalytic subunit of bovine enterokinase.J B1l Chem.1993，268(31)，23311-7)。由于EP裂解融合蛋白所釋放出的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列，因而可以作為蛋白表達(dá)體系中融合蛋白的切割試劑(Schmidt，F(xiàn).R.Recombinant express1n systems in the pharmaceutical industry.Appl Microb1lB1technol.2004，65(4)，363-72)。但是天然的腸激酶來源有限，并且提取分離的成本高，加之天然提取的腸激酶易被其它蛋白酶污染，易造成切割融合蛋白同時又降解了目的產(chǎn)物。而基因工程技術(shù)正可以彌補(bǔ)這些不足，因而運(yùn)用基因工程的方法生產(chǎn)腸激酶已成趨勢。
[0004]目前已經(jīng)釆用了原核或真核表達(dá)系統(tǒng)成功得到了有生物活性的重組豬、牛、小鼠等腸激酶輕鏈蛋白，但很少關(guān)于鏘魚腸激酶輕鏈基因工程方面的研究。(Kitamoto，Y.et al.cDNA sequence and chromosomal localizat1n of human enterokinase, theproteolytic activator of trypsinogen.B1chemistry.1995， 34(14)， 4562-8;Matsushima, M.et al.Structural characterizat1n of porcine enteropeptidase.JB1l Chem.1994，269(31)，19976-82 ;Yahagi，N.et al.Complementary DNA cloningand sequencing of rat enteropeptidase and tissue distribut1n of its mRNA.B1chem B1phys Res ComM/Lun.1996， 219(3)， 806-12)
國外已有大量關(guān)于牛腸激酶研究的報道，但有關(guān)鏘魚腸激酶研究很少。有研究表明，鏘魚腸激酶的特異性要遠(yuǎn)高于目前常見的牛腸激酶、豬腸激酶和人腸激酶(Ogiwara，K.Specificity of the medaka enteropeptidase serine protease and its usefulness asa b1technological tool for fus1n-protein cleavage.Proc Natl Acad Sci USA.2007，104(17)，7021-6)。其對非特異多肽底物的酶切活性不到牛腸激酶的1/100，因此，如果能利用基因工程方法得到重組鏘魚腸激酶，其應(yīng)用價值將比重組牛腸激酶更高。目前，重組鏘魚腸激酶輕鏈尚無商業(yè)化產(chǎn)品。
[0005]由于鏘魚腸激酶輕鏈中含有9個半胱氨酸(Cys)殘基，其中形成4對二硫鍵，有一個游離的Cys殘基不參加配對，因此在重組表達(dá)時，極易形成二硫鍵錯配，導(dǎo)致異構(gòu)體出現(xiàn)。已有文獻(xiàn)報道，將游離的Cys殘基突變可能會有助于蛋白質(zhì)的復(fù)性折疊(Ivanenkov,V.Bacterial express1n, characterizat1n, and disulfide bond determinat1n ofsoluble human NTPDase6 (CD39L2) nucleotidase:1mplicat1ns for structure andfunct1n.B1chemistry.2003, 42(40)， 11726-35)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，將鏘魚腸激酶輕鏈的第112位Cys置換為絲氨酸(Ser)。這一定點(diǎn)突變(C112S)可以大大降低mEPL在蛋白折疊過程中發(fā)生二硫鍵錯配的幾率，顯著提高其鏘魚腸激酶輕鏈的產(chǎn)量。而且，這一突變并不影響mEPL的活性與特異性。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的重組鏘魚腸激酶輕鏈突變體，并提供其在大腸桿菌中高效表達(dá)、復(fù)性、層析純化的方法，該方法適用于鏘魚腸激酶輕鏈的大規(guī)模制備。
[0008]本發(fā)明在已報道的鏘魚腸激酶輕鏈的核苷酸序列和大腸桿菌偏愛密碼子的使用原則的基礎(chǔ)上(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),設(shè)計(jì)編碼新型鏘魚腸激酶輕鏈氨基酸的核苷酸序列，進(jìn)行體外合成，在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并利用變復(fù)性與純化技術(shù)得到高活力的mEPL融合蛋白。這一新型鏘魚腸激酶輕鏈帶有C112S突變。
[0009]本發(fā)明公開了:
1、一種新型重組鏘魚腸激酶輕鏈蛋白(mEPL)，其特征在于具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0010]2、一種DNA分子，其特征在于編碼權(quán)利要求1所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0011]3、一種載體，含有權(quán)利要求2所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，其中載體為含有T7啟動子的載體。
[0012]4、權(quán)利要求3所述的載體，為載體PET32。
[0013]5、一種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求4所述的載體，為原核細(xì)胞。
[0014]6、權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，為大腸桿菌。
[0015]7、一種制備權(quán)利要求1所述新型重組鏘魚腸激酶輕鏈的方法，該方法包括:
a)根據(jù)蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)，將鏘魚腸激酶輕鏈野生型基因易形成二硫鍵錯配的半胱氨酸進(jìn)行突變，全基因合成mEPL核苷酸序列；
b)構(gòu)建含有人工合成的mEPL基因的重組質(zhì)粒pTRX-d-mEPL；
c)將重組質(zhì)粒pTRX-d-mEPL轉(zhuǎn)化至權(quán)利要求5、6任一所述的宿主細(xì)胞中，得到含有重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞；
d)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，表達(dá)新型重組鏘魚重組腸激酶輕鏈； e)層析純化得到目標(biāo)蛋白mEPL。
[0016]本發(fā)明得到了一種新型鏘魚腸激酶輕鏈蛋白質(zhì)mEPL，以熒光多肽Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β NA (Sigma, St.Louis, MO)作為特異性底物，Boc-E (OBzl)-AR-MCA 和 Z-FR-MCA (Peptide Institute, Osaka, Japan)作為非特異性底物，檢測純化后mEPL的活性與特異性。結(jié)果顯示,與Invitrogen公司的同類產(chǎn)品EKMaxTM相比，本發(fā)明生產(chǎn)的mEPL的酶活力達(dá)到了 EKMaxTM的2倍，且特異性為EKMaxTM的80倍以上。并對底物蛋白進(jìn)行酶切，驗(yàn)證了其活性。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果:
本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了新型鏘魚腸激酶輕鏈的重組表達(dá)，經(jīng)復(fù)性純化后每升發(fā)酵液可獲得10mg純度在95%以上的mEPL蛋白，活性檢測其活性為EKMaxTM的2倍，特異性為EKMaxTM的80倍以上，無論表達(dá)量還是特異性，都是目前已有報告中最高的(Ostapchenko，V.G.et al.Dissecting structural basis of the unique substrate selectivity of humanenteropeptidase catalytic subunit.J B1mol Struct Dyn.2012, 30(1)， 62-73)。
[0018]本發(fā)明提供的一種高特異性重組鏘魚腸激酶輕鏈，以及一種高效生產(chǎn)重組鏘魚腸激酶輕鏈的生產(chǎn)方法，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，通過簡單的復(fù)性和純化，獲得快速、簡便、穩(wěn)定、高活性、高特異性的重組鏘魚腸激酶輕鏈蛋白。該酶適用于生物制藥工程、基因工程、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的而研究和應(yīng)用。
【附圖說明】
[0019]圖1.人工合成mEPL基因與鏘魚體內(nèi)表達(dá)的野生型基因核苷酸序列對比圖2.重組質(zhì)粒pTRX-d-mEPL的酶切鑒定電泳分析
圖3.重組質(zhì)粒pTRX-d-mEPL構(gòu)建示意圖
圖4.重組鏘魚腸激酶輕鏈表達(dá)條件優(yōu)化的SDS-PAGE分析圖譜(上清)
圖5.重組鏘魚腸激酶輕鏈表達(dá)條件優(yōu)化的SDS-PAGE分析圖譜(沉淀)
圖6.重組鏘魚腸激酶輕鏈復(fù)性條件優(yōu)化的SDS-PAGE分析圖譜圖7.重組鏘魚腸激酶輕鏈的表達(dá)，及純化的SDS-PAGE分析圖譜圖8.重組腸激酶催化亞基對特異性底物及非特異性底