魚類神經(jīng)壞死病毒來源的蛋白轉導域及其制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種魚類（特別是石斑魚）神經(jīng)壞死病毒來 源的蛋白轉導域，以及該蛋白轉導域的制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 石斑魚作為一種名貴的海水經(jīng)濟魚類。在其養(yǎng)殖過程中，特別是在其仔稚魚 階段，魚體本身的獲得性免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，一旦感染魚類神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus, NNV，一種β諾達病毒），將導致接近100%的死亡率，給養(yǎng)殖戶造成重大 的經(jīng)濟損失。目前，雖然已經(jīng)開發(fā)出多種防御和治療NNV的藥物，但藥物到達靶部位需要經(jīng) 歷一個很漫長的過程，特別是具有選擇透過性的細胞膜的存在，使得治療性分子和藥物很 難到達細胞內(nèi)作用部位。因此，即使藥物進入體內(nèi)，可能由于作用位點沒有特異性和難以達 到有效濃度，使得藥物的效果不理想。
[0003] 蛋白轉導域（protein transduction domain，PTD)的出現(xiàn)，可能為藥物的導入提 供了一種新的途徑。PTD是一類一般少于30個氨基酸的短肽，這些肽段可以與貨物（治療 性分子或藥物）經(jīng)過共價或者非共價結合，通過觸發(fā)細胞的信號轉導途徑，通過巨胞飲、網(wǎng) 格蛋白或者膜窖蛋白等途徑，有效地進入細胞內(nèi)部。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種導入效率高的新型蛋 白轉導域。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述蛋白轉導域的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的再一個目的是提供上述蛋白轉導域的用途。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種魚類神經(jīng)壞死病毒來源的蛋白轉導域，其 氨基酸序列如SEQ ID: 1所示。
[0008] 優(yōu)選地，所述魚類為石斑魚。更優(yōu)選地，所述石斑魚為斜帶石斑魚 (orange-spotted grouper)〇
[0009] 本發(fā)明還提供了含有上述蛋白轉導域的組合物。
[0010] 本發(fā)明還提供了編碼上述蛋白轉導域的核酸。
[0011] 本發(fā)明還提供了包括上述核酸的表達載體。
[0012] 本發(fā)明還提供了包括上述表達載體的重組宿主細胞。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述蛋白轉導域的制備方法，其步驟如下：
[0014] (1)引物設計：
[0015] 上游引物F :
[0016] AATTCCGCAAAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACCACCAAGTAACGA(EcoR I)
[0017] 下游引物R :
[0018] AGCTTCGTTACTTGGTGGTCGCGGGTTTTGCCAATTTCTTCTCACCTTTGCGG(Hind III)
[0019] (2)獲取目的基因：
[0020] 將合成好的引物進行退火，在將引物干粉進行稀釋時，加水至終濃度為20 μΜ，配 制50 μ 1的退火反應體系，分別加入上下游引物各20 μ 1，然后加入5XLA Taqase Buffer 1〇μ1，吹打混勻，設置梯度溫度退火，98°C，5min，然后 97°C，30s ;96°C，30s ;95°C，30s ; 94 °C, 30s ；93 °C, 30s ；92 °C, 30s ；91 °C, 30s ；90 °C , 30s ；89 °C, 30s ；88 °C, 30s ；87 °C, 30s ； 86 °C, 30s ；85 °C, 30s ；84 °C, 30s ；83 °C, 30s ；82 °C, 30s ；81 °C, 30s ；80 °C, 30s ；79 °C, 30s ； 78°C，30s ;77°C，30s ;76°C，30s ;75°C，30s ;74°C，30s ;73°C，30s ;72°C，30s ;71°C，30s，然 后將退火的引物放到室溫中，讓其自然冷卻，從而獲得目的基因的脫氧核糖核苷酸序列；
[0021] (3)將目的基因構建到含GFP的pRSET-A原核表達載體上，選擇EcoR I和Hind III作為酶切位點；
[0022] (4)將酶切好的目的基因和原核表達載體進行連接：
[0023] 將配制好的目的基因和原核表達載體的雙酶切反應體系放入37°C水浴鍋中，3個 小時，配制1 %的瓊脂糖核酸膠，將酶切好的目的基因和原核表達載體進行連接；酶切好的 目的基因和原核表達載體按照摩爾比3:1進行連接；
[0024] (5)將連接好的原核表達載體轉化到DH5 α感受態(tài)細胞：
[0025] 將連接好的含有改造過的目的基因的質(zhì)粒轉化到DH 5 α感受態(tài)細胞中；
[0026] (6)挑選陽性克隆進行測序；
[0027] (7)將構建好的含有改造過的目的基因的pRSET-A原核表達載體進行提?。哼x取 相應的陽性結果的菌株進行擴大培養(yǎng)然后進行保菌種和質(zhì)粒的提?。?br>[0028] (8)將構建好的含有改造過的目的基因的pRSET-A原核表達載體轉化到BL21感受 態(tài)細胞中；
[0029] (9)將目的蛋白進行表達；
[0030] (10)對目的蛋白進行純化。
[0031] 本發(fā)明還提供了上述蛋白轉導域用于攜帶外源物質(zhì)進入細胞的用途。
[0032] 本發(fā)明還提供了上述蛋白轉導域在用于制備魚類疾病防治藥物中的應用。
[0033] 本發(fā)明的蛋白轉導域肽段中富含賴氨酸，通過對已知的蛋白轉導域的研宄發(fā)現(xiàn)， 可能是這些賴氨酸觸發(fā)了受體，進而激活細胞的信號途徑，從而作為一種新的蛋白轉導域， 將外源物質(zhì)攜帶進入細胞的內(nèi)部，應用到魚類疾病的預防和治療中。
[0034] 因此我們首先將該肽段與綠色熒光蛋白（GFP蛋白）在pRSET-A原核表達載體融 合表達，將目的蛋白純化后，在魚類細胞GB/SB細胞中的浸泡結果顯示該肽段可以在熒光 顯微鏡下觀察到焚光信號。
[0035] 與已知的蛋白轉導域R8, Penetratin與GFP融合表達的蛋白進入魚類細胞相比， 該肽段GFP融合表達的蛋白利用更短的時間，而且具有更高的進入魚類細胞的效率。
[0036] 根據(jù)試驗結果，發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒（orange-spotted grouper nervous necrosis virus，0GNNV)的衣殼蛋白（capsid protein，CP)所形成的類病毒粒子 (virus-like particle，VLP)可以有效地進入魚類細胞及部分哺乳類動物細胞，最終確定 了本發(fā)明的肽段，也就是RKGEKKLAKPATTK，可以作為一種新的PTD在魚類細胞上使用。通過 導入效率比較發(fā)現(xiàn)，該肽段比其他三種成熟PTD在魚類細胞上的導入效率高達30%以上。
【附圖說明】
[0037] 圖1是本發(fā)明的蛋白轉導域的雙酶切結果。
[0038] 圖2是本發(fā)明的蛋白轉導域的考馬斯亮藍結果。
[0039] 圖3是不同PTD在SB細胞的導