一種從胭脂蘿卜籽中制備高純度萊菔素的方法
【專利說明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本專利屬于萊菔素的制備及穩(wěn)定性研宄領(lǐng)域，特別涉及到一種從胭脂蘿卜籽中快速穩(wěn)定制備高純度萊菔素的方法。
二、【背景技術(shù)】
[0002]萊菔素是十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷在黑芥子酶中水解而成的一類異硫氰酸酯類物質(zhì)，學(xué)名為1-異硫氰酸-4-甲磺酰基-丁燒，又名萊菔硫素，萊菔子素，溶于水、甲醇和氯仿，易溶于乙醚，不溶于石油醚。萊菔素是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最強抗癌成分之一，它能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生II型解毒酶，防止致癌物質(zhì)破壞健康細胞的遺傳因子，具有廣闊的市場前景。
[0003]現(xiàn)有制備萊菔素的技術(shù)，例如申請?zhí)枮?01110117510.3、名稱為“一種萊菔素的制備方法”的發(fā)明專利，該專利公開的方法是:取萊菔素藥材粉碎后加2?3倍水，調(diào)pH4.0?
5.0，40?50°C酶解30?60min，升溫至80 °C滅酶，再加5?6倍水攪拌提取，過濾，用大孔吸附樹脂吸附其中的萊菔素，再以50?70%乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)過納濾、反滲透后濃縮再用二氯甲烷萃取，最后獲得純度達到75.6%的萊菔素。又如申請?zhí)枮?01210011551.9，名稱為“一種蕓薹屬蔬菜種子中蘿卜硫素的富集與提取”的發(fā)明專利，該專利公開的方法為:蕓薹屬蔬菜種子粉碎后加入體積比1: 3?1: 5的Trris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH為6.0?8.0，再加維生素C及Zn+，激活蔬菜種子中內(nèi)源黑芥子酶，水解自身的硫代葡萄糖苷，形成具有抗癌作用的萊菔素，最后用乙酸乙酯萃取孵育液中的萊菔素，經(jīng)過濾、真空濃縮、超聲浸提，得到萊菔素。上述方法存在的主要問題是:①選用二氯甲烷、乙酸乙酯等有機溶劑萃取萊菔素，此類溶劑毒性大，易揮發(fā)或水溶性高，污染環(huán)境；?用大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附水溶液中的目標物，時間長且吸附效率低。由于萊菔素在水溶液中30分鐘即開始重排或異構(gòu)化，長時間的靜態(tài)吸附導(dǎo)致其大量重排或異構(gòu)成蘿卜硫素氰或異噁烷等雜質(zhì)，這將顯著降低萊菔素的收得率并增加分離純化的難度；③上述方法僅采用萃取和吸附進行純化，由于萃取和吸附對目標物的選擇性均低，制備出的萊菔素純度均不高，僅能用于食品領(lǐng)域，附加值低。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是針對現(xiàn)有萊菔素制備技術(shù)的不足之處，提供一種快速穩(wěn)定制備高純度萊菔素的方法。該方法具有操作簡單、高效、連續(xù)性強、溶劑可反復(fù)回收利用，樹脂可再生循環(huán)，廣品穩(wěn)定且純度尚等特點。
[0005]本發(fā)明所依據(jù)的原理是:①萊菔素，即1-異硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷中的2-烯基為非極性基團，可與非極性吸附樹脂形成疏水相互作用，從而與極性雜質(zhì)分離；②吸附于非極性樹脂的萊菔素用無水甲醇脫附，使萊菔素快速轉(zhuǎn)移至甲醇中，萊菔素在甲醇中穩(wěn)定，既避免了因濃縮熱產(chǎn)生的重排等異構(gòu)化反應(yīng)，也可長期保存；③制備型液相色譜是基于分析型液相色譜原理的工業(yè)化設(shè)備，由于塔板數(shù)極高，可以將萊菔素與非極性雜質(zhì)分離，獲得高純度萊菔素制備液；④冷凍干燥是將濕物料或溶液在較低溫度(_10°C?-50°c )下凍結(jié)成固態(tài)，然后在絕對真空度(1.3?13Pa)下使其中的水分直接升華，最終使物料脫水的干燥技術(shù)。經(jīng)過制備型液相色譜分離獲得的高純度萊菔素制備液經(jīng)過甲醇快速脫附、低溫真空脫甲醇濃縮及預(yù)凍成冰，再在冷凍干燥機內(nèi)升華水分，即可快速制備出穩(wěn)定、高純度的萊菔素。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下途徑實現(xiàn)的，一種從胭脂蘿卜籽中制備高純度萊菔素的方法，以市售脫脂后的胭脂蘿卜籽粉為原料，經(jīng)過制備萊菔素粗提取液、制備萊菔素粗分離液、制備高純度萊菔素濃縮液及制備高純度萊菔素凍干物的步驟快速穩(wěn)定制備出純度高達99%以上的萊菔素，其具體的工藝步驟如下:
[0007](I)制備萊菔素粗提取液
[0008]首先，配制出pH為3.0?4.5、濃度為0.1?0.5mol/L的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液或pH為3.0?4.5、濃度為0.1?0.5mol/L檸檬酸緩沖溶液，再按照市售脫脂后的胭脂蘿卜籽粉質(zhì)量(kg)與該緩沖溶液體積(L)之比為1: 4?1: 10的比例，在攪拌下將市售脫脂后的胭脂蘿卜籽粉分散于該緩沖溶液中，于30?40°C恒溫水解反應(yīng)1.5?3h。水解反應(yīng)完成后進行過濾，分別收集濾過液和濾渣，對收集的濾渣，烘干后用作家畜飼料添加劑；對收集的濾液，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2?4后用管式離心機以10000?15000r/min的轉(zhuǎn)速離心，分別收集離心清液和離心沉淀，對收集的離心沉淀，即為萊菔子蛋白質(zhì)，與過濾收集的濾渣合并，烘干后用作家畜飼料添加劑；對收集的離心清液，即為萊菔素粗提取液，放置于O?4°C的冷藏室中避光保存，用于下一步制備萊菔素粗分離液。
[0009](2)制備萊菔素粗分離液
[0010]第(I)步完成后，將活化的大孔吸附樹脂sp700或sp850，用濕法裝入中壓層析柱，其中大孔吸附樹脂體積(L)與第(I)步制備的萊菔素粗提取液體積(L)之比為1: 10?I: 16，再安裝好轉(zhuǎn)換接頭并分別連接恒流泵和紫外檢測器，就組裝成萊菔素粗分離系統(tǒng)。萊菔素粗分離系統(tǒng)組裝完成后，開啟恒流泵，將第(I)步制備的萊菔素粗提取液以I?2BV/h的流速泵入萊菔素粗分離系統(tǒng)中，分別收集用過柱液和吸附萊菔素的大孔吸附樹脂柱，對收集的過柱液，泵入生化處理池進行處理，達標后排放；對收集的吸附萊菔素的大孔吸附樹脂柱，先用I?3BV的純凈水沖洗，再泵入3?6BV、體積濃度為10?15%的甲醇洗脫液，以I?3BV/h的流速洗脫雜質(zhì)。分別收集沖洗液、體積濃度為10?15%的過柱甲醇洗脫液和經(jīng)過該過柱甲醇洗脫液處理的大孔吸附樹脂柱，對收集的沖洗液，泵入生化處理池進行處理，達標后排放；對收集的體積濃度為10?15%的過柱甲醇洗脫液，送入溶劑回收車間，減壓蒸餾回收甲醇；對收集的經(jīng)過體積濃度為10?15%的甲醇洗脫液處理的大孔吸附樹脂柱，接著用體積濃度為50?65%的甲醇洗脫液進行洗脫，所用體積濃度為50?65%的甲醇洗脫液體積為3?6BV，洗脫液流速為I?3BV/h。分別收集體積濃度為50?65%的過柱甲醇洗脫液和脫附萊菔素的大孔吸附樹脂柱，對收集的體積濃度為50?65%的過柱甲醇洗脫液，即為萊菔素粗分離液，用于下一步制備高純度萊菔素濃縮液；對收集的脫附萊菔素的大孔吸附樹脂柱，泵入體積濃度為80?100%的甲醇洗脫液進行洗脫，所用該甲醇洗脫液體積為3?6BV，洗脫液流速為I?3BV/h。分別收集體積濃度為80?100%的過柱甲醇洗脫液和經(jīng)過濃度為80?100%的甲醇洗脫液處理后的樹脂柱，對收集的體積濃度為80?100%的過柱甲醇洗脫液，送入溶劑回收車間，減壓蒸餾回收甲醇；對收集的經(jīng)過濃度為80?100%的甲醇洗脫液處理后的樹脂柱，用I?2BV的純凈水沖洗。分別收集過柱沖洗液和經(jīng)過純凈水沖洗的大孔吸附樹脂柱，對收集的過柱沖洗液，送入溶劑回收車間，減壓蒸餾回收甲醇；對收集的經(jīng)過純凈水沖洗的大孔吸附樹脂柱，即為再生萊菔素粗分離系統(tǒng)，可再次用于粗分離萊菔素。
[0011](3)制備高純度萊菔素濃縮液
[0012]第⑵步完成后，將活化的羅門哈斯大孔吸附樹脂Amberl ite?XAD1600或AmberliteTMXAD761，用濕法裝入中壓層析柱，其中羅門哈斯大孔吸附樹脂體積(L)與第(2)步制備的萊菔素粗分離液體積(L)之比為1: 10?1: 16，再安裝好轉(zhuǎn)換接頭并分別連接恒流泵和紫外檢測器，就組裝成萊菔素醇水置換系統(tǒng)。萊菔素醇水置換系統(tǒng)組裝完成后，將第(2)步制備的萊菔素粗分離液濃縮后泵入制備型液相色譜柱，流動相甲醇與水的比例為30: 70，流速為20?25mL/min，按照色譜圖收集流出液，即得到萊菔素制備液。用恒流泵以I?2BV/h的流速泵入第(3)步組裝的萊菔素醇水置換系統(tǒng)，分別收集過柱液和吸附萊菔素的大孔吸附樹脂柱，對收集的過柱液，減壓真空濃縮回收甲醇，再泵入生化處理池進行處理，達標后排放；對收集的吸附萊