一種β-瓊膠酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能基因篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種β-瓊膠酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓊膠廣泛存在于江蘺、石花菜等紅藻的細(xì)胞壁，是一種重要的海藻多糖。瓊膠結(jié)構(gòu) 復(fù)雜，由1，3連接的β -D-半乳吡喃糖和1，4連接的3, 6-內(nèi)醚-a -L-半乳吡喃糖殘基反 復(fù)交替連接組成骨架，并包含硫酸基、甲基等取代基。瓊膠酶是指一類能夠降解瓊膠，生成 瓊膠寡糖的糖苷水解酶，其主要來源是海洋細(xì)菌，少部分來源于陸地環(huán)境中的細(xì)菌和海洋 軟體動物。瓊膠酶分類方式多樣，根據(jù)瓊膠酶降解瓊脂糖時(shí)作用的糖苷鍵和產(chǎn)物的不同， 瓊膠酶可分為兩大類：α -瓊膠酶和β -瓊膠酶。α -瓊膠酶作用于瓊脂糖的α -1，3糖苷 鍵，生成瓊寡糖；β -瓊膠酶作用于β -1，4糖苷鍵，降解產(chǎn)物為新瓊寡糖。根據(jù)序列相似性， β-瓊膠酶通常被劃分到四個糖苷水解酶家族（GH，GlucosideHydrolase):分別是GH16、 GH50、GH86和GH118家族；而α-瓊膠酶則屬于GH96家族。根據(jù)作用方式不同，可以將瓊 膠酶分類為內(nèi)切酶和外切酶。通常情況下，內(nèi)切酶（大多數(shù)的GH16、GH86和GH118家族的 瓊膠酶）作用于多糖長鏈的內(nèi)部，以較大聚合度的寡糖分子為降解的終產(chǎn)物；而外切酶（大 多數(shù)的GH50家族的瓊膠酶）作用于多糖或高聚合度寡糖的兩端，產(chǎn)生低聚合度的寡糖或單 糖供細(xì)胞進(jìn)一步的降解利用，在多糖的降解過程中起重要作用。
[0003] 瓊膠酶降解瓊膠所產(chǎn)生的瓊膠寡糖具有多種生理活性，具有抑菌性，并且具有明 顯的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)效應(yīng)。新瓊二糖對腸道菌群的生長還具有益生元效應(yīng)。利用瓊膠酶 降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖具有專一性和高效性、條件溫和、產(chǎn)物易于回收等特點(diǎn)，是未來獲取 瓊膠寡糖的主要方向。除此以外，利用瓊膠酶降解瓊脂糖凝膠回收膠條中的DNA或RNA、降 解海藻細(xì)胞壁以制備原生質(zhì)體、水解海藻多糖以分析多糖結(jié)構(gòu)等，也是瓊膠酶在分子生物 學(xué)研宄中的重要應(yīng)用。由于能源危機(jī)和全球變暖等氣候問題，生物乙醇作為一種可持續(xù)的 生物燃料成為現(xiàn)在的研宄熱點(diǎn)。利用瓊膠酶和α-新瓊寡糖降解酶將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的瓊膠多糖 轉(zhuǎn)化成單糖，再通過糖化作用和發(fā)酵作用將單糖轉(zhuǎn)化為酒精。因此，將紅藻高效地轉(zhuǎn)化為生 物酒精也是瓊膠酶的一個重要應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種β-瓊膠酶及其應(yīng)用，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明提供一種β -瓊膠酶，包含有
[0006] 1)氨基酸序列為SEQ ID NO :1的β -瓊膠酶；
[0007] 2)在1)進(jìn)行取代、缺失、添加一個或幾個氨基酸形成的，且具有1)中酶學(xué)性質(zhì)的 β-瓊膠酶；
[0008] 編碼上述β -瓊膠酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO :2 ;
[0009] 本發(fā)明還提供一種重組大腸桿菌，轉(zhuǎn)化有攜帶上述基因的表達(dá)質(zhì)粒。
[0010] 上述的重組大腸桿菌，為大腸桿菌YM01-5 (Escherichia coli YM01-5)，于2015 年3月25日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2015164〇
[0011] 本發(fā)明的β -瓊膠酶5用于制備新瓊寡糖，例如新瓊二糖。
[0012] 本發(fā)明的β-瓊膠酶酶能夠特異性地降解瓊膠產(chǎn)生唯一的降解產(chǎn)物一一新瓊二 糖。本發(fā)明的大腸桿菌重組株YM01-5/pET24a(+)、BL21(DE3)所表達(dá)的重組β-瓊膠酶，表 達(dá)水平高，易于純化，所以通過本發(fā)明可以大量生產(chǎn)重組β -瓊膠酶，成本低。
【附圖說明】
[0013] 圖1 :薄層層析檢測瓊膠酶ΥΜ01-5的降解產(chǎn)物圖，
[0014] 圖2 :重組瓊膠酶ΥΜ01-5降解產(chǎn)物（新瓊二糖）的離子肼質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。
[0016] 實(shí)施例1 : β -瓊膠酶基因 YMO1-5的獲取
[0017] 嗜瓊膠卵鏈菌（Catenivulum agarivorans gen. nov. sp. nov.) YMOIt由本實(shí)驗(yàn)室 篩選、鑒定、保藏，通過對其全基因組進(jìn)行測序分析得到15個瓊膠酶基因及其基因序列，包 括13個β-瓊膠酶基因和2個α-瓊膠酶基因，ΥΜ01-3是其中的一個β-瓊膠酶基因。利 用生物學(xué)軟件 Primer5. 0 設(shè)計(jì)上游引物（5'-GGATCCGATGAAATATCTAGATTACGGTTATAGCC-3'） 和下游引物（5' -CCCTCGAGTTTGCTGTCAGCCTGCACTTG-3'）以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反 應(yīng)，PCR反應(yīng)組成如下（10 μ 1反應(yīng)體系）：ddH20 10. 5 μ 1、上游和下游引物各0· 5 μ 1，DNA 模板 1 μ l、2XMasterMix 12. 5 μ 1。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 lmin，64°C 退火lmin，72°C延伸I. 5min，72°C終延伸lOmin，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物回 收得到β-瓊膠酶基因 YM01-5,其具體核苷酸序列為SEQ ID NO :2,其翻譯的酶的氨基酸 序列為 SEQ ID N0:1。YM01-5 和來自于 Cellvibrio sp.BR 的 agarase(WP_007640756.1) (相似度 63 % )、Glaciecola agarilytica 的 beta-agarase B(WP_008306471. 1)(相 似度 59 % )，Thalassomonas agarivorans 的 beta_agarase(AGT98631. 1)(相似度 57 % )，Saccharophagus degradans 2_40 的 Exo-beta-agarase (4BQ2)(相似度 58 % )， Alteromonas sp. E-1 的 beta_agarase(BAE97587. 1)(相似度 62% )。上述結(jié)果表明本發(fā)明 篩選得到了一個新型的瓊膠酶基因。
[0018] 實(shí)施例2 :大腸桿菌表達(dá)載體YM01-5/pET24a(+)的構(gòu)建
[0019] 將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET24a(+)分別用BamH I和Xhol I雙酶切，酶切體系 (20 μ 1)如下：
[0020] 反應(yīng)體系 I :ddH20 8 μ 1，PCR 產(chǎn)物 8 μ 1，BamH Il μ 1，Xhol Il μ 1，IOXBuffer 2 μ I
[0021] 37°C酶切1小時(shí)，電泳后分別回收兩個目的片段2409bp和5. 3Kb，二者分別與 β-瓊膠酶YM01-5基因全長片段和表達(dá)載體PET24a(+)片段大小相同，用DNALigation Kit 連接，連接體系（1〇μ1)如下：Solution I 5yl，DNA 片段 1.5yl，pET24a(+)載體 L ΙμL， CldH2O 2. 4 μ 1。16°C連接16小時(shí)即可獲得大腸桿菌表達(dá)載體YM01-5/pET24a(+)，用于轉(zhuǎn)化 大腸桿菌BL21(DE3)。
[0022] 實(shí)施例3:大腸桿菌重組株YM01-5/pET24a(+)/BL21(DE3)的構(gòu)建
[0023] 向200 μ IE. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μ lYM01-5/pET24a(+