鯽魚鯉皰疹病毒2型特異性pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鯽魚鯉皰瘆病毒2型的基因檢測(cè)試劑及 檢測(cè)方法，適用于鯽魚鯉皰瘆病毒2型的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、鯉皰瘆病毒2型的檢測(cè)及基因工程 技術(shù)等領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鯉皰瘆病毒2型（Cyprinidherpesvirus2,CyHV-2)，又稱皰瘆病毒性造血器官 壞死病病毒（Herpesviralhaematopoieticnecrosisvirus，HVHNV)或金魚造血器官壞死 病毒（Goldfishhaematopoieticnecrosisvirus，GFHNV)。該病毒在 1992-1993 年首次在 日本養(yǎng)殖的金魚被分離鑒定，也是該病的首次報(bào)道，曾給日本金魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng) 濟(jì)損失，死亡率高達(dá)100%。該病毒2009年在我國(guó)江蘇地區(qū)首次出現(xiàn)，瀕死魚的血液會(huì)順著 鰓絲流出，漁民稱之為"鰓出血"，2010年在該地區(qū)廣泛暴發(fā)，2011~2012年，該病毒繼續(xù)蔓 延，導(dǎo)致鯽魚主要養(yǎng)殖區(qū)的異育銀鯽暴發(fā)了 "鰓出血"病，死亡率達(dá)80%以上。根據(jù)流行病 學(xué)調(diào)查，綜合電鏡觀察、分子檢測(cè)和回歸感染實(shí)驗(yàn)，確定"鰓出血"病原為CyHV-2。該病傳播 范圍廣、傳染性強(qiáng)、發(fā)病快、致死率高，已給我國(guó)鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為我 國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最為嚴(yán)重的病毒性疾病之一。為了及早發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖魚類是否被CyHV-2感 染，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法。
[0003] 傳統(tǒng)病毒病的診斷需要進(jìn)行病毒分離，細(xì)胞培養(yǎng)，電鏡觀察以及免疫檢測(cè)等方法， 缺乏對(duì)病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、敏感的檢測(cè)方法。PCR方法具有操作簡(jiǎn)單、特異、快速、敏感等優(yōu) 點(diǎn)，正逐步應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)與研宄中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鯽魚鯉皰瘆病毒2 型特異性PCR檢測(cè)方法，能快速、高效地用于鯉皰瘆病毒2型的檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0006] 1.鯽魚鯉皰瘆病毒2型的PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： [0007] (1) 2X反應(yīng)混合緩沖液，包含以下成分：
[0008] KC1，
[0009] MgCl2，
[0010] Tris-HCl，pH5. 8，
[0011] dNTP；
[0012] (2)檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)合成：上游引物C-F:5'-CGCAGCGGGATCATCCCAATC-3'，下游引 物C-R:5' -CGATGTGTATTTCATATAGTG-3'，濃度為 10y M ;
[0013] (3)Taq酶；
[0014] (4)滅菌的ddH20 ;
[0015] (5)陽性對(duì)照液：鯽魚鯉皰瘆病毒2型基因組DNA;
[0016] (6)陰性對(duì)照液：健康鯽魚基因組DNA。
[0017] 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，采用試劑盒檢測(cè)鯽魚鯉皰瘆病毒2 型的方法為：
[0018] (1)鯽魚鯉皰瘆病毒2型DNA的提?。喝■w、脾臟、腎臟組織，加入滅菌處理的雙蒸 水，用玻璃勾衆(zhòng)器充分研磨后，置于_20°C冰箱反復(fù)凍融3次，6000rpm低溫離心10分鐘，取 上清，加入200yLTris-飽和酚，充分振蕩混勻后，靜置5分鐘，然后12000rpm離心5分鐘， 取上清液加入等量的酚：氯仿：異戊醇抽提二次，取上清加入2倍體積的異丙醇，混勻后，靜 置10分鐘，12000rpm離心10分鐘，去掉上清后，加入的75%的乙醇，靜置5分鐘，12000rpm 離心10分鐘，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH20溶解，即為試驗(yàn)用DNA模板，提取 的DNA模板置于-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0019] (2)PCR反應(yīng)體系：采用PCR反應(yīng)體系，在PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入2X反應(yīng)混合緩 沖液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用滅菌超純水加至總體積，同時(shí)分別 用陽性對(duì)照液和陰性對(duì)照液作為模板，設(shè)置陽性和陰性對(duì)照組，混合均勻后離心數(shù)秒，置于 PCR反應(yīng)儀上；
[0020] (4)PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5分鐘；然后95°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共循環(huán)30次；72°C延伸10分鐘，最后4°C保存；
[0021] (5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙 錠0. 5 y g/mL)上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物 的預(yù)期大?。?br>[0022] (6)結(jié)果與判定：在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，若檢測(cè)樣品在526bp處 出現(xiàn)明亮的條帶，而陰性對(duì)照沒有目的條帶，則為鯉皰瘆病毒2型陽性；若陽性對(duì)照可見目 的條帶，而檢測(cè)樣品無目的條帶出現(xiàn)，則為陰性，沒有或不是所要檢測(cè)的目的鯉皰瘆病毒2 型。
[0023] 優(yōu)選的技術(shù)方案為：
[0024] 1.鯽魚鯉皰瘆病毒2型的PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：
[0025] (3) 2X反應(yīng)混合緩沖液1.OmL，包含以下成分：
[0026]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鯽魚鯉皰瘆病毒2型的PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1)2X反應(yīng)混合緩沖液，包含以下成分： KCl， MgCl2， Tris-HCl，pH5. 8， dNTP ； ⑵檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)合成：上游引物C-F :5' -CGCAGCGGGATCATCCCAATC-3'，下游引物 C-R :5' -CGATGTGTATTTCATATAGTG-3'，濃度為 10 y M ; (3) Taq 酶； ⑷滅菌的ddH20 ; (5) 陽性對(duì)照液：鯽魚鯉皰瘆病毒2型基因組DNA ; (6) 陰性對(duì)照液：健康鯽魚基因組DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，采用試劑盒檢測(cè)鯽魚鯉皰瘆病毒2型的 方法為： (1) 鯽魚鯉皰瘆病毒2型DNA的提取：取鰓、脾臟、腎臟組織，加入滅菌處理的雙蒸水， 用玻璃勻漿器充分研磨后，置于_20°C冰箱反復(fù)凍融3次，6000rpm低溫離心10分鐘，取上 清，加入200 y L Tris-飽和酚，充分振蕩混勻后，靜置5分鐘，然后12000rpm離心5分鐘， 取上清液加入等量的酚：氯仿：異戊醇抽提二次，取上清加入2倍體積的異丙醇，混勻后，靜 置10分鐘，12000rpm離心10分鐘，去掉上清后，加入的75 %的乙醇，靜置5分鐘，12000rpm 離心10分鐘，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用CldH2O溶解，即為試驗(yàn)用DNA模板，提取 的DNA模板置于-70 °C保存?zhèn)溆茫? (2) PCR反應(yīng)體系：采用PCR反應(yīng)體系，在PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入2 X反應(yīng)混合緩沖液， 上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用滅菌超純水加至總體積，同時(shí)分別用陽性 對(duì)照液和陰性對(duì)照液作為模板，設(shè)置陽性和陰性對(duì)照組，混合均勻后離心數(shù)秒，置于PCR反 應(yīng)儀上； (4) PCR反應(yīng)條件：95 °C預(yù)變性5分鐘；然后95 °C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸 30秒，共循環(huán)30次；72 °C延伸10分鐘，最后4°C保存； (5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠 0. 5 y g/mL)上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的 預(yù)期大??； (6) 結(jié)果與判定：在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，若檢測(cè)樣品在526bp處出現(xiàn) 明亮的條帶，而陰性對(duì)照沒有目的條帶，則為鯉皰瘆病毒2型陽性；若陽性對(duì)照可見目的條 帶，而檢測(cè)樣品無目的條帶出現(xiàn)，則為陰性，沒有或不是所要檢測(cè)的目的鯉皰瘆病毒2型。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種公開了鯽魚鯉皰疹病毒2型特異性PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明所述的鯽魚鯉皰疹病毒2型的PCR快速檢測(cè)試劑盒，包括：2×反應(yīng)混合緩沖液1.0mL；優(yōu)選設(shè)計(jì)的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；陽性對(duì)照液；陰性對(duì)照液；ddH2O。本發(fā)明克服了現(xiàn)有鯉皰疹病毒2型檢測(cè)方法的不足，提供一種新型PCR快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明對(duì)鯽魚鯉皰疹病毒2型進(jìn)行臨床診斷不僅切實(shí)可行，且具有快速、準(zhǔn)確、特異的優(yōu)點(diǎn)，滿足了臨床診斷的要求，為檢測(cè)鯽魚鯉皰疹病毒2型提供了便利條件。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104846124
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510264013
【發(fā)明人】雷燕, 肖洋, 盧剛, 張文文, 張會(huì)軍, 馬家好
【申請(qǐng)人】廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月21日