一種切向流超濾技術(shù)提取生姜蛋白酶的方法
【專利說(shuō)明】
(一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種切向流超濾技術(shù)提取生姜蛋白酶的方法，屬于輕工、食品領(lǐng)域。
(二)
【背景技術(shù)】
[0002]生姜蛋白酶是生姜深加工綜合利用的高附加值產(chǎn)品之一，是一種琉基蛋白水解酶類，具有水解蛋白酶和膠原蛋白酶雙重性質(zhì)，可用于肉類嫩化、酒類澄清、凝乳、水解大豆蛋白等食品加工處理中，對(duì)大腸桿菌、啤酒酵母和青霉有抑制生長(zhǎng)效果。生姜蛋白酶能特異水解脯氨酸匕位含有脯氨酸的多肽和蛋白質(zhì)，這種對(duì)脯氨酸的特殊親和性使其在生化研宄中成為一種很有前途的工具酶。
[0003]超濾是一種以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)，用于截留水中膠體大小的顆粒，而水和低分子量溶質(zhì)則允許透過(guò)膜。由于超濾具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、無(wú)相變、處理效率高、節(jié)能和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，故已廣泛用于食品、飲料、藥物、涂料等行業(yè)和物質(zhì)的分離回收，在廢水處理上也有較多的應(yīng)用。但是普通超濾在超濾過(guò)程中，由于被截留的雜質(zhì)在膜表面上不斷積累，會(huì)產(chǎn)生濃差極化現(xiàn)象，當(dāng)膜面溶質(zhì)濃度達(dá)到某一極限時(shí)即生成凝膠層，使膜的透水量急劇下降，這使得超濾的應(yīng)用受到一定程度的限制。切向流(也稱為“錯(cuò)流”)超濾改變了普通超濾流向垂直濾膜而采用流向平行濾膜，從而可以將大分子從膜的表面帶走不形成死端過(guò)濾，在滲余物流體中產(chǎn)生緊靠濾膜的壓力，使溶質(zhì)和小分子通過(guò)濾膜。切向流超濾能更快捷、高效地進(jìn)行生物分子的分離與純化處理，可用于低至10毫升、高達(dá)數(shù)千升樣品溶液的濃縮和脫鹽處理，也可以用于不同大小生物分子的分離、細(xì)胞懸液收集、以及發(fā)酵液和細(xì)胞裂解液的澄清。
[0004]蛋白質(zhì)分離純化是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的工作。由于蛋白質(zhì)存在于復(fù)雜的生物體系中，且自身不穩(wěn)定，遇熱或遇某些溶劑易變性失活，故傳統(tǒng)的蒸餾、溶劑萃取等分離技術(shù)并不適用于其分離純化，而色譜法用于蛋白質(zhì)的分離純化，雖具有高分辨率的特點(diǎn)，但操作繁瑣、難放大、提取量少、成本高，在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。與上述方法相比，切向流超濾技術(shù)作為一種典型的膜分離技術(shù)，適用于任何能預(yù)處理成汁液的原料，無(wú)需干燥，具有應(yīng)用范圍更廣、能耗更低、效率更高、無(wú)相變、無(wú)需添加任何化學(xué)試劑、操作簡(jiǎn)便、條件溫和等諸多優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)脫鹽、脫醇、濃縮、分級(jí)分離及內(nèi)毒素去除等過(guò)程中具有廣闊的應(yīng)用前景。
(三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是研發(fā)一種切向流超濾技術(shù)提取生姜蛋白酶的新方法。其方法是用乙醇法得到生姜蛋白酶溶液，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得姜酶分子量，根據(jù)姜酶分子量選擇合適的膜包，用配套的切向流系統(tǒng)進(jìn)行切向流超濾提取，分級(jí)分離，收集不同區(qū)間的液體，得到含酶溶液，置于冰浴中緩慢加入乙醇靜置沉淀，再經(jīng)抽濾去除上清液后收集沉淀得濕酶粉，冷凍干燥后得酶粉。(四)
【附圖說(shuō)明】
[0006]圖1切向流超濾技術(shù)提取生姜蛋白酶的工藝流程
[0007]圖1中I是鮮姜，2是乙醇法，3是生姜蛋白酶溶液，4是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，5是分子量為33.3KDa的生姜蛋白酶，6是分子量為15.7KDa的生姜蛋白酶，7是切向流系統(tǒng)，8是分子量為50KDa的膜包，9是分子量大于50KDa的回流端液體，10是通過(guò)50KDa膜包收集的透過(guò)端液體，11是分子量為1KDa的膜包，12分子量小于1KDa的透過(guò)端液體，13是通過(guò)1KDa膜包收集的回流端液體，14是分子量為30KDa的膜包，15是分子量在10_30KDa之間的透過(guò)端液體，16是分子量在30-50KDa之間的回流端液體，17是酶活測(cè)定，18是乙醇，19是冰浴，20抽濾，21是濕酶粉，22冷凍干燥，23酶粉。
(五)
【具體實(shí)施方式】
[0008]將鮮姜⑴用乙醇法⑵制備生姜蛋白酶溶液(3)，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(4)測(cè)出有兩種生姜蛋白酶，分子量分別為33.3KDa(5)和15.7KDa(6)。根據(jù)生姜蛋白酶的分子量和現(xiàn)有市售膜包選擇分子量為10、30、50KDa的膜包，將生姜蛋白酶溶液(3)用配套的切向流系統(tǒng)(7)進(jìn)行超濾提取，先用分子量為50KDa的膜包(8)超濾，去掉分子量大于50KDa的回流端液體(9);收集透過(guò)端液體(10)用分子量為1KDa的膜包(11)超濾，去除分子量小于1KDa的透過(guò)端液體(12);收集回流端液體(13)用分子量為30KDa的膜包
(14)超濾，分別收集分子量在10-30KDa之間的透過(guò)端液體(15)和分子量在30_50KDa之間的回流端液體(16)，對(duì)兩組液體進(jìn)行酶活測(cè)定(17)，發(fā)現(xiàn)生姜蛋白酶主要存在于30-50KDa區(qū)間，即分子量為33.3KDa的組分(16)有酶活，將其在冰浴條件下緩慢加入乙醇(18)至終濃度為50%?70% (v/v)，冰浴(19)中靜置5?8h后取出，抽濾(20)得濕酶粉(21)，冷凍干燥(22)，得酶粉(23) ο
[0009]測(cè)得生姜蛋白酶比活力大小為5.369X 106U/g，比超濾前酶比活力(3.102 X 16U/g)高 73.082% ο
[0010]應(yīng)用上述方法可部分純化并大量提取生姜蛋白酶，具有高效率、低能耗、無(wú)相變、無(wú)需添加任何化學(xué)試劑、操作簡(jiǎn)便、條件溫和、得到的酶活高等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以提高生產(chǎn)效率，是一種應(yīng)用性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣的新方法，有很好的產(chǎn)業(yè)化和市場(chǎng)前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種切向流超濾技術(shù)提取生姜蛋白酶的方法，其特征在于:將鮮姜用乙醇法制備生姜蛋白酶溶液，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)出有兩種生姜蛋白酶，分子量分別為.33.3KDa和15.7KDa。根據(jù)生姜蛋白酶的分子量和現(xiàn)有市售膜包選擇分子量為10、30、50KDa的膜包，將生姜蛋白酶溶液用配套的切向流系統(tǒng)進(jìn)行超濾提取，先用分子量為50KDa的膜包超濾，去掉分子量大于50KDa的回流端液體；收集透過(guò)端液體用分子量為1KDa的膜包超濾，去除分子量小于1KDa的透過(guò)端液體；收集回流端液體用分子量為30KDa的膜包超濾，分別收集分子量在10-30KDa之間的透過(guò)端液體和分子量在30-50KDa之間的回流端液體，對(duì)兩組液體進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)生姜蛋白酶主要存在于30-50KDa區(qū)間，即分子量為.33.3KDa的組分有酶活，將其在冰浴條件下緩慢加入乙醇至終濃度為50%?70% (v/v)，冰浴中靜置5?8h后取出，抽濾得濕酶粉，冷凍干燥，得酶粉。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種切向流超濾技術(shù)提取生姜蛋白酶的新方法。其方法是用乙醇法得到生姜蛋白酶溶液，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得姜酶分子量，根據(jù)姜酶分子量選擇合適的膜包，用配套的切向流系統(tǒng)進(jìn)行切向流超濾提取，分級(jí)分離，收集不同區(qū)間的液體，得到含酶溶液，置于冰浴中緩慢加入乙醇靜置沉淀，再經(jīng)抽濾去除上清液后收集沉淀得濕酶粉，冷凍干燥后得酶粉。
【IPC分類】C12N9-50
【公開號(hào)】CN104845956
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510317142
【發(fā)明人】唐曉珍, 位思清, 喬旭光, 李鋒, 高曉東, 賈傳璽
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年6月11日