一種東南亞型地中海貧血的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種東南亞型地中海貧血的檢測技術(shù)，具體涉及一種東南亞型地中海 貧血致病基因的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 地中海貧血（thalassemia，簡稱：地貧）是一組嚴(yán)重威脅人類健康的致死、致殘的 遺傳性血液病，因最早發(fā)現(xiàn)于地中海地區(qū)而得名。其共同特點是珠蛋白基因缺陷使血紅蛋 白中的珠蛋白肽鏈合成減少或不能合成，導(dǎo)致慢性溶血性貧血。根據(jù)合成障礙的肽鏈不同 可把地貧分為a、0、6、60、y60等類型，其中以a-和0 -地貧最為常見。在我國， 地貧高發(fā)于長江以南各省區(qū)，其中a-地貧基因攜帶者檢出率為2%_18%，0-地貧為1%_7%。 地貧基因攜帶者之間婚配可使下一代有1/4的概率患有重癥地貧。重型a-地貧患兒死胎 或出生后就死亡。重型地貧患者除干細(xì)胞移植外尚無其他有效的根治方法，需輸血以 維持生命，大部分患者死于成年之前，東南亞型（southeastasian,簡寫：SEA)地中海貧血 屬于a-地貧的一種。
[0003] 目前國內(nèi)的各級醫(yī)療系統(tǒng)對于地中海貧血的篩查主要采用如下的方法：先用紅細(xì) 胞滲透脆性一管法(基礎(chǔ)醫(yī)療系統(tǒng)和計生系統(tǒng)的主要方法）和/或血液學(xué)表型篩查（MCV、 MCH)進(jìn)行地貧篩查，然后對篩查陽性的樣本進(jìn)行基因診斷。紅細(xì)胞滲透脆性一管法是利用 地貧紅細(xì)胞的滲透脆性與正常人紅細(xì)胞的滲透脆性不同的原理來進(jìn)行篩選的，它的優(yōu)點是 方法簡便經(jīng)濟(jì)、適合基層單位的使用，但是它同時也存在著特異性差，誤診率高的缺點。在 篩選出疑似地貧的患者的同時，有大量的缺鐵性貧血等非地貧的紅細(xì)胞脆性相關(guān)疾病被誤 篩。血液學(xué)表型篩查（MCV、MCH)的篩查方法是《地中海貧血預(yù)防控制操作指南》推薦的方法， 性價比高，篩查準(zhǔn)確，在血球儀準(zhǔn)確度得到保障的情況下，以MCV〈82fL為標(biāo)準(zhǔn)，可以篩查出 近100%的輕型a及0地貧的基因攜帶者，但目前只有部分基層單位及計生系統(tǒng)擁有血球 儀，由于日常樣本量少，無法購買儀器配套的質(zhì)控品及參加國家的血常規(guī)的全國室間質(zhì)控， 因此準(zhǔn)確度無法得到保障，從而限制了這種方法的普及。此外，血液學(xué)表型篩查法無法檢出 部分靜止型地貧，說明其敏感性遠(yuǎn)不如基因診斷方法。
[0004] 目前地貧基因診斷普遍使用跨越斷裂點的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Gap-PCR)診斷缺失型 a-地貧，PCR結(jié)合反向斑點雜交技術(shù)（PCR-RDB)診斷0-地貧及突變型a-地貧。Gap-PCR 需要通過瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，耗時且產(chǎn)物易污染；PCR-RDB需要PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物變性、 雜交等多個步驟，操作復(fù)雜繁瑣，耗時長。這些基因診斷方法一來成本較高(約400元/人 份)，無法對廣泛人群進(jìn)行普查，二來開展這些項目對場地、儀器、人員素質(zhì)要求較高，也很 難在基層醫(yī)院和農(nóng)村地區(qū)廣泛推廣。受阻突變體系聚合酶鏈反應(yīng)（AMRS-PCR)、多重連接探 針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)、高效變相液相色譜（DHPLC)、高分辨率溶解曲線（HRM)與PCR-測序的方 法也被用于地貧的研宄，但是這些方法同樣存在上述兩個問題。
[0005] 專利申請?zhí)枮?01110098786. 1的發(fā)明專利提供了 一種抗體檢測SEA型地 貧特異性珠蛋白的方法，此方法檢測靶點為地中海貧血特異性蛋白。專利申請?zhí)枮?201110081598. 8的發(fā)明專利提供了一種檢測SEA珠蛋白基因缺失的熒光定量PCR試劑盒， 此方法需要使用熒光定量PCR儀，在專門的PCR室進(jìn)行操作。專利申請?zhí)枮?00710074203. 5 的發(fā)明專利提供了一種檢測SEA地中海貧血的核酸膜條，該方法需要將待測樣本擴(kuò)增后與 核酸雜交膜條進(jìn)行雜交顯色。以上方法均不能達(dá)到快速簡便、可在基層醫(yī)院及農(nóng)村操作的 要求。
[0006] 綜上所述，目前地貧檢測需要研宄一種新的敏感性高、成本低、操作簡單、快速的 地貧檢測方法，才能更好的符合我國國情，滿足基層醫(yī)院和廣大農(nóng)村進(jìn)行廣泛地貧防控的 需要，真正有效的減少重癥地貧患兒的出生，減少社會及家庭的負(fù)擔(dān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] ( 1)要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有東南亞型地中海貧血檢測方法中存在的敏感性低、成本高、操作 復(fù)雜、耗時長的缺點，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種敏感性高、成本低、操作簡單、快 速的東南亞型地中海貧血的檢測方法。
[0008] (2)技術(shù)方案 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了這樣一種東南亞型地中海貧血的檢測方法，包 括以下步驟： a、 設(shè)計SEA地中海貧血特異性LAMP引物和人基因組內(nèi)參LAMP引物，包括SEA-FIP、 SEA-BIP、SEA-F3、SEA-B3、control-FIP、control-BIP、control_F3、control_B3 共 8 條引 物； 所設(shè)計的SEA地中海貧血特異性LAMP引物如下： SEA-F3:CGATCTGGGCTCTGTGTTC SEA-B3:TGGAGTGCAGTGTTGTAGTC SEA-FIP:GGACGACCGAGTTCCTGCGATTTGAGGGAAGGAGGGGAGAAG SEA-BIP:CCTTGGGGAGGTTCACTTGGAGAGCCTTGAACTCCTGGACTT 所設(shè)計的人基因組內(nèi)參LAMP引物如下： control-FIP：ATGCAGAGATATTGCTATTGGCACCATTCTAAAGAATAACAGT control-BIP:AGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTCTTATCCCAACCATAAAATAAAAGC control-F3:GATACAATGTATCATGCCTCTT control-B3:TGGACTCAGAATAATCCAGC b、 提取人血基因組DNA:采用Chelex100陽離子樹脂吸附法提取，取300ul全血樣本， 堿裂解紅細(xì)胞，加入5%Chelex-100陽離子樹脂，溫度56°C，水浴20min，高速渦旋振蕩樣 本5~10s，高速離心2min，吸取上清作為步驟c中的人血基因組DNA樣本； c、LAMP擴(kuò)增：把步驟b中所取得的人血基因組DNA樣本分為對照管和SEA檢測管兩 份； 在對照管中加入control-FIP、control-BIP、control_F3、control_B3 引物，并加入LAMP反應(yīng)緩沖液、BstDNA聚合酶、ddH20,形成對照管LAMP反應(yīng)體系； 在SEA檢測管中加入SEA-F3、SEA-B3、SEA-FIP、SEA-BIP引物，并加入LAMP反應(yīng)緩沖 液、BstDNA聚合酶、ddH20,形成SEA檢測管LAMP反應(yīng)體系； 對照管LAMP反應(yīng)體系和SEA檢測管反應(yīng)體系在溫度56°C、時間45min的反應(yīng)條件下進(jìn) 行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，分別得到對照管LAMP產(chǎn)物和SEA檢測管LAMP產(chǎn)物； d、LAMP產(chǎn)物檢測：使用紫外燈熒光顯色的方法，對步驟c中得到的對照管LAMP產(chǎn)物和SEA檢測管LAMP產(chǎn)物進(jìn)行檢測；將對照管和SEA檢測管放至紫外燈下，當(dāng)對照管和SEA檢 測管均出現(xiàn)綠色熒光時，判斷為SEA地貧陽性；當(dāng)對照管出現(xiàn)綠色熒光、SEA檢測管無綠色 熒光時，判斷為SEA地貧陰性；當(dāng)對照管和SEA檢測管均無綠色熒光時，判斷為反應(yīng)失敗，需 重新檢測。
[0009] 步驟c中，LAMP反應(yīng)緩沖液的成分和含量分別為：Tris(pH8. 8)40mM、KCl 20禮、]\%50416 1111、（順4)250420 1111、了￥6611 200.20%、甜菜堿1.611、(1見1^2.8 111163(*、]\111(：12 1mM、鈣黃綠素50yM; 步驟c中，對照管LAMP反應(yīng)體系的成分和含量分別為：LAMP反應(yīng)緩沖液12. 5y1、control-FIP40pmoleach、control-BIP40pmoleach、control-F3 10pmoleach、 control_B3 10pmoleach、BstDNA聚合酶 8U、人血基因組DNA5yl、ddH20upto25yl; 步驟c中，SEA檢測管LAMP反應(yīng)體系成分和含量分別為：LAMP反應(yīng)緩沖液12. 5y1、SEA-FIP40pmoleach、SEA_BIP40pmoleach、SEA_F310pmoleach、SEA_B310pmoleach、 BstDNA聚合酶 8U、人血基因組DNA5y1、ddH20upto25y1。
[0010] (3)有益效果 本發(fā)明提供了一種利用LAMP對SEA地中海貧血進(jìn)行檢測的方法，通過熒光直接激發(fā) 陽性樣本的綠色熒光進(jìn)行檢測，本發(fā)明的檢測方法特異性好、靈敏度高、成本低、操作簡單， 可在1小時內(nèi)檢測出結(jié)果，同時避免了傳統(tǒng)LAMP檢測中的開蓋操作，減少了污染的可能性， 可滿足高通量樣本檢測，特別適合基層單位的檢驗部門對SE