試 化合物的情況下培養(yǎng)的hSLC相關(guān)的額外的代謝物，與在不存在該測試化合物的情況下培 養(yǎng)的hSLC的情況進(jìn)行比較。在一些方面，一種或多種額外的代謝物包括精氨酸、ADMA、胱硫 醚，和/或其一個片段、加合物、減去物或損失物。在一些方面，使用一種物理分離方法鑒定 一種或多種額外的代謝物。在一些方面，一種物理分離方法包括質(zhì)譜法。在一些方面，質(zhì)譜 法包括液相色譜法/電噴射離子化質(zhì)譜法。在一些方面，使用一種比色或免疫學(xué)測定測量 一種或多種額外的代謝物。
[0023] 在本發(fā)明的方法的一些方面，該方法進(jìn)一步包括測定精氨酸或其片段、加合物、減 去物或損失物的倍數(shù)改變與ADM或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變的比率， 其中少于至少約0. 9或大于至少約I. 1的比率指示了該測試化合物的致畸性；并且大于至 少約0. 9和少于至少約I. 1的比率指示了該測試化合物的非致畸性。
[0024] 術(shù)語"和/或"意指所列舉的要素的一個或所有或所列舉的要素的任何兩個或更 多個的組合。
[0025] 詞語"優(yōu)選的"和"優(yōu)選地"是指本發(fā)明的在某些情況下可以提供某些益處的實施 例。然而，在相同或其他情況下，其他實施例也可以是優(yōu)選的。此外，一個或多個優(yōu)選實施 例的敘述不意味著其他實施例是無用的，并且不旨在將其他實施例排除在本發(fā)明的范圍之 外。所述的一個或多個實施例和說明書中對"一個實施例（one embodiment) "、"本發(fā)明的 一個實施例"、"一個實施例（an embodiment) "、"一個實例實施例"等的提及意指所述的一 個或多個實施例可包括一個具體的特點、結(jié)構(gòu)或特征，但每個實施例可以不必須包括該具 體的特點、結(jié)構(gòu)或特征。此外，此類短語不必須參考相同的實施例。進(jìn)一步，當(dāng)一個具體的 特點、結(jié)構(gòu)或特征是與一個實施例相關(guān)地描述的，應(yīng)理解它在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的知 識范圍內(nèi)影響與其他實施例相關(guān)的此類特點、結(jié)構(gòu)或特征，無論是否明確描述。
[0026] 術(shù)語"包含"及其變體，在這些術(shù)語在本說明書和權(quán)利要求中出現(xiàn)的情況下，不具 有限制性含義。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)用語言"包含"來說明實施例時，還提供了就"由……組成"和 /或"主要由……組成"而言所說明的其他類似實施例。
[0027] 除非另外說明，"一個（或一種）"、"該（the)"、和"至少一個（或一種）"可互換 地使用并且意指一個（或一種）或多于一個（或一種）。
[0028] 在以下說明中，為了解釋的目的，列出特定數(shù)目、參數(shù)和試劑是為了提供對本發(fā)明 的深入了解。然而，應(yīng)理解，可以在沒有這些具體細(xì)節(jié)的情況下實踐本發(fā)明。在一些情況下， 可省略或簡化眾所周知的特點以使本發(fā)明明顯。
[0029] 而且在此，通過端點敘述的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包括的所有數(shù)值（例如，1至 5 包括 1、1· 5、2、2· 75、3、3· 80、4、5 等）。
[0030] 除非另外指明，本說明書和權(quán)利要求書中使用的表達(dá)組分的量、分子量等等的所 有數(shù)值應(yīng)被理解為在所有情況中被術(shù)語"約"修飾。因此，除非另外相反地指明，在本說明 書和權(quán)利要求書中列出的數(shù)值參數(shù)是近似值，這些近似值可以取決于本發(fā)明所尋求獲得的 所希望的特性而不同。
[0031] 對于在此所披露的包括不連續(xù)的步驟的任何方法來說，可以按任何可行的順序來 進(jìn)行這些步驟。并且，在適當(dāng)時，可以同時進(jìn)行兩個或更多個步驟的任何組合。
[0032] 本發(fā)明的以上概述不旨在說明本發(fā)明的每個披露的實施例或每個實現(xiàn)方式。下面 的說明更具體地舉例說明示意性實施例。在本申請全文的幾處，通過實例的列舉提供了指 導(dǎo)，這些實例能以不同組合使用。在每個例子中，所敘述的列表僅作為代表性組并且不應(yīng)被 解釋為排他性列表。
[0033] 附圖簡要說明
[0034] 圖IA和1B.針對以下項的板設(shè)計：在1期實驗使用的單個暴露水平處理的非靶 向的代謝組學(xué)（圖1A)和在2期實驗使用的多個暴露水平處理的靶向生物標(biāo)記物實驗（圖 1B)。兩個板都合并有一種參照設(shè)計，其中實驗對照或參照處理（0. 1% DMS0)存在于每個板 上。使用僅有培養(yǎng)基（缺少細(xì)胞）的對照以評估該測試化合物對樣本基質(zhì)的影響。將每個 孔作為一個個體樣本進(jìn)行分析。實心圓表示細(xì)胞樣本，并且實心正方形描述了培養(yǎng)基對照 樣本。
[0035] 圖2.靶向生物標(biāo)記物測定的圖形表示。將人胚胎干（hES)細(xì)胞暴露于跨距四個 對數(shù)單位的九個濃度的一種測試化合物。鳥氨酸/胱氨酸比率（ο/c比率；灰色曲線）和 細(xì)胞活力（黑色曲線）的劑量響應(yīng)曲線是使用一種四參數(shù)對數(shù)邏輯模型擬合的。通過其中 ο/c比率的劑量響應(yīng)曲線與致畸閾值（0. 88 ;灰色線）相交的內(nèi)插點預(yù)測的濃度表示如下的 暴露水平，在該暴露水平處一種代謝擾動具有致畸可能性（即，致畸性可能性：〇/c比率，空 心圓）。來自細(xì)胞活力（實心圓）的致畸性可能濃度是如下內(nèi)插點，在該內(nèi)插點處該細(xì)胞 活力劑量響應(yīng)曲線超過該致畸性閾值。該致畸性可能性創(chuàng)建了一個基于暴露的雙面毒性模 型：一個中暴露未以與致畸性相關(guān)方式擾亂代謝（淺陰影框），并且另一個中暴露可在代謝 中引起一個可能地致畸轉(zhuǎn)變（深陰影框）。X軸是該化合物的濃度（μΜ)。細(xì)胞活力測量和 o/c比率測量兩者都以由y軸上的Δ表示的相同比例存在。ο/c比率的y軸值是參照處理 標(biāo)準(zhǔn)化（倍數(shù)改變）值的比率（鳥氨酸/胱氨酸）?；盍y量的y軸值是標(biāo)準(zhǔn)化為參照處 理細(xì)胞活力RFU的處理細(xì)胞活力RFU。
[0036] 圖3A和3B.針對已知的人致畸劑和非致畸劑的分類方案的圖形表示，利用治療 Cmax濃度來設(shè)置該分類窗。針對o/c比率（灰色曲線）的劑量響應(yīng)曲線是使用一種四參數(shù) 對數(shù)邏輯模型擬合的，并且被用以插入如下濃度，在此濃度處ο/c比率與該致畸性閾值（致 畸性可能性，空心圓）相交。當(dāng)該致畸性可能濃度高于該人治療C max時，一種測試化合物被 預(yù)測為一種非致畸劑（圖3A)。當(dāng)該致畸性可能濃度低于該人治療Cmax時，一種測試化合物 被預(yù)測為一種致畸劑（圖3B)。此處概述的相同邏輯也適用于活力測量。X軸是該化合物 的濃度（μ M)。o/c比率的y軸值是參照處理標(biāo)準(zhǔn)化（倍數(shù)改變）值的比率（鳥氨酸/胱 氨酸）。
[0037] 圖4A、4B、和4C.在實驗1期時測量的鳥氨酸（圖4A)、胱氨酸（圖4B)的代謝擾 動和o/c比率（圖4C)。每個點表示這9個獨立實驗區(qū)組的平均值。實心點指示致畸劑， 并且空心點指示非致畸劑。誤差條是平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。垂直灰色線表示該致畸性閾值。X 軸是每個代謝物（圖A和4B)的參照標(biāo)準(zhǔn)化倍數(shù)改變或鳥氨酸/胱氨酸參照標(biāo)準(zhǔn)化值（圖 4C)的比率。7軸是按非致畸劑和致畸劑排序的處理?？招募^指示如下的范圍，在此范圍 處一種化合物將被分類為一種非致畸劑。實心箭頭指示如下的范圍，在此范圍處一種化合 物將被分類為一種致畸劑。
[0038] 圖5A和5B.化合物針對在2期中測定的o/c比率（TP)的致畸性可能濃度和來自 革巴向生物標(biāo)記物測定的針對訓(xùn)練集（training set，圖5A)和測試集（test set，圖5B)的 Cmax值之間的差異的可視化。實心點對應(yīng)于致畸劑，并且空心點對應(yīng)于非致畸劑。TP和Cmax 之間的差異少于〇的處理被分類為致畸劑，并且TP和Cmax之間的差異大于0的處理被分類 為非致畸劑。X軸是對數(shù)底10轉(zhuǎn)化的致畸劑可能性濃度值減去對數(shù)底10轉(zhuǎn)化的C max濃度 值（參見表6和7)。y軸是按非致畸劑和致畸劑排序的處理?？招募^指示如下的范圍， 在此范圍處一種化合物將被分類為一種非致畸劑。實心箭頭指示如下的范圍，在此范圍處 一種化合物將被分類為一種致畸劑。 1依維莫司（everolimus)的Cmax低于該測定中使用的 最低暴露水平，這種化合物的ο/c比率以低于該致畸性閾值起始，所以它被分類為一種致 畸劑。
[0039] 圖6A至6F.訓(xùn)練集化合物的代表性子集的靶向生物標(biāo)記物測定結(jié)果（表6)。顯 示了針對4種已知的人致畸劑：薩力多胺（圖6A)、全反式視黃酸（圖6B)、丙戊酸（圖6C)、 5-氟尿嘧啶（圖6D)以及2種非致畸劑：視黃醇（圖6E)和糖精（圖6F)的活力分析（黑 色曲線）和o/c比率（灰色曲線）的劑量響應(yīng)曲線。X軸是該化合物的濃度（μM)。細(xì)胞 活力測量和ο/c比率測量兩者都以由y軸上的Λ表示的相同比例存在。ο/c比率的 y軸 值是參照處理標(biāo)準(zhǔn)化（倍數(shù)改變）值的比率（鳥氨酸/胱氨酸）。針對活力測量的y軸值 是標(biāo)準(zhǔn)化為參照處理細(xì)胞活力RFU的處理細(xì)胞活力RFU。垂直黑色虛線指示化合物特異性 Cmax，并且水平灰色線指示致畸性閾值（〇. 88)?？招膱A表示針對o/c比率的致畸劑可能性濃 度（TP)。淺色和深色陰影區(qū)表示如下濃度，在此濃度處該化合物分別被預(yù)測為非致畸或致 畸。這些點是平均值，并且誤差條是平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。這些圖的解釋概述在圖2和3中。
[0040] 圖7A和7B.針對兩種測試集化合物（表7):洛伐他?。▓D7A)和拉帕替尼（圖 7B)，靶向生物標(biāo)記物測定結(jié)果與大鼠體內(nèi)發(fā)育毒性結(jié)果的比較。顯示了靶向生物標(biāo)記物測 定針對活力分析（黑色線）和o/c比率（灰色線）的劑量響應(yīng)曲線。X軸是該化合物的濃 度UM)。細(xì)胞活力測量和o/c比率測量兩者都以由y軸上的△表示的相同比例存在。〇/ c比率的y軸值是參照處理標(biāo)準(zhǔn)化（倍數(shù)改變）值的比率（鳥氨酸/胱氨酸）。針對活力 測量的y軸值是標(biāo)準(zhǔn)化為參照處理細(xì)胞活力RFU的處理細(xì)胞活力RFU。垂直黑色虛線指示 化合物特異性C max，并且水平灰色線指示致畸性閾值（0. 88)?？招膱A表示針對o/c比率的 致畸劑可能性濃度（TP)。淺色和深色陰影區(qū)表示如下濃度，在此濃度處該化合物分別被預(yù) 測為非致畸或致畸?；疑摼€表示如下濃度，在此濃度處在該大鼠體內(nèi)發(fā)育毒性測試中觀 察到一個陽性結(jié)果。這些點是平均值，并且誤差條是平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。這些圖的解釋概述 在圖2和3中。
[0041] 圖8.概述了該靶向生物標(biāo)記物測定的發(fā)育的圖形，與使用未知化合物時相比較。
[0042] 圖9顯示針對每種訓(xùn)練集藥劑，ADMA和胱氨酸的參照處理標(biāo)準(zhǔn)化比率的比率。
[0043] 圖10顯示針對每種訓(xùn)練集藥劑，胱硫醚和胱氨酸的參照處理標(biāo)準(zhǔn)化比率的比率。
[0044] 示意性實施方式的詳細(xì)說明
[0045] 本發(fā)明提供人-特異性體外測定毒性的方法，特別是使用人干細(xì)胞樣細(xì)胞（hSLC) 測定發(fā)育毒性以及藥物和其他非-藥物化合物致畸性的方法。本發(fā)明利用hSLC和代謝組 學(xué)以提供一種預(yù)測的、定量的、所有-人的體外篩選以預(yù)測化合物的人發(fā)育毒性的方法。本 方法克服了與種間動物模型相關(guān)的限制，并提供了創(chuàng)新和穩(wěn)健的替代體外模型系統(tǒng)以預(yù)測 化學(xué)品的發(fā)育毒性。更多預(yù)測性發(fā)育毒性篩選的應(yīng)用會減少出生缺陷的流行并增加藥物和 化學(xué)品安全性。
[0046] 通過在培養(yǎng)基中測量代謝擾動，本發(fā)明提供了基于暴露的體外測定，該代謝擾動 可被用作針對發(fā)育毒性的可能性的早期信號。
[0047] 在本發(fā)明的這些方法的情況下，可以使用多種人干細(xì)胞樣細(xì)胞（hSLC)中的任何 一種，以預(yù)測化學(xué)品實體的發(fā)育毒性。人干細(xì)胞樣細(xì)胞包括但不限制于多能性未分化的人 胚胎干細(xì)胞（hESC)、人誘導(dǎo)多能性（iPS)細(xì)胞、人胚狀體和hSLC衍生的譜系特異性細(xì)胞。
[0048] hESC是直接從胚胎植入前的人胚胎分離的多能性自我更新的細(xì)胞，這些細(xì)胞重演 了體外器官發(fā)生。譜系特異性前體細(xì)胞衍生自hESC，并已進(jìn)入一個特定的細(xì)胞譜系，但相 對于該特異性譜系內(nèi)的細(xì)胞類型仍保留了多能性。例如，神經(jīng)前體細(xì)胞已定向神經(jīng)分化， 但就其神經(jīng)細(xì)胞類型而言仍保留不受限性。如此處使用的，術(shù)語"人胚胎干細(xì)胞（hESC)" 意在包括最初衍生自正發(fā)育的胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的未分化的干細(xì)胞，并且特別包括多能性 未分化的人干細(xì)胞及其部分分化的細(xì)胞類型（例如，正分化的hESC的下游祖細(xì)胞）。如 此處提供的，hESC的體外培養(yǎng)是多能性的并且未被永生化，并且使用本領(lǐng)域中良好建立 的方法可被誘導(dǎo)以產(chǎn)生譜系特異性細(xì)胞和分化的細(xì)胞類型。在實踐本發(fā)明的方法中有用 的