一種毒殺蚊幼蟲的雙價重組球孢白僵菌及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本方法涉及引入外來遺傳物質(zhì)修飾的細(xì)菌，具體涉及引入外來基因修飾的重組球 孢白僵菌，該重組球孢白僵菌可用于毒殺蚊幼蟲。
【背景技術(shù)】
[0002] 蚊是一種重要的疾病媒介，能夠傳播瘧疾、絲蟲病、圣路易腦炎、日本流行性乙型 腦炎、登革熱、西尼羅熱和黃熱病等疾病。蚊媒病流行范圍廣，傳播力強，發(fā)病率高，全球每 年有上億人感染瘧疾、登革熱等蚊媒病，死亡人數(shù)過百萬。我國已知蚊類18個屬、371個種 和亞種，涵蓋瘧疾、登革熱、乙型腦炎、絲蟲病的主要媒介。中國疾控中心報告顯示我國僅 2006年瘧疾發(fā)病就超過6萬例，疫情出現(xiàn)回升，流行性乙型腦炎在近年也出現(xiàn)局部爆發(fā)?？?之，蚊媒傳染病的流行嚴(yán)重危害人類生命健康，影響社會的穩(wěn)定，阻礙經(jīng)濟的發(fā)展。
[0003] 目前成功應(yīng)用的生物殺蟲劑主要是蘇蕓金桿菌，然而長期的使用也帶來了抗藥性 的出現(xiàn)。球孢白僵菌作為一類重要的天敵生物資源，因其易于生產(chǎn)、寄主范圍廣（能浸染15 個目149個科的700多種昆蟲）、侵染期長、不傷害人和其他脊椎動物，尤其是其可貴的流行 潛力而倍受人們的關(guān)注。從20世紀(jì)50年代開始，球孢白僵菌已被應(yīng)用于防治玉米螟、大豆 食心蟲和甘薯葉甲，林業(yè)上應(yīng)用球孢白僵菌大面積防治松毛蟲并獲得了明顯成功。
[0004] 因為球孢白僵菌通過入侵昆蟲表皮感染從而殺死昆蟲的作用過程較緩慢，因而 有報道將外源毒力基因轉(zhuǎn)入該菌以提高毒力。蘇云金桿菌的植物殺蟲劑蛋白（Vegetative insecticidal proteins，Vip3A)能夠通過消化道感染快速殺死鱗翅目害蟲，但是其在害蟲 防控方面的使用僅限于整合于轉(zhuǎn)基因的植物中。一個表達(dá)Vip3Aal蛋白的重組球孢白僵 菌被用于通過攝食及表皮吸附等方式感染東方棉樹葉蟲，消化道感染該重組球孢白僵菌的 東方棉樹葉蟲的半致死濃度及半致死時間顯著低于野生型，其殺死害蟲的效率獲得了顯著 提高。然而通過體表感染的東方棉樹葉蟲致死率與野生型沒有區(qū)別（Qin Y，Ying SH，Chen Yj Shen ZCj Feng MG. Integration of insecticidal protein Vip3Aalinto Beauveria bassiana enhances fungal virulence to Spodoptera litura larvae by cuticle and per Os infection. Appl Environ Microbiol. 2010 ;76 (14):4611-8.)〇
[0005] 白僵菌侵入昆蟲體內(nèi)的過程依賴于大量的水解酶、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶。據(jù)報道， 白僵菌特異的幾丁質(zhì)酶Bbchitl和Bbchit2,都沒有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（chitin-binding domains，ChBD)，F(xiàn)an 等人將絲香（Bombyx mori)幾丁 質(zhì)酶的 ChBD 與 Bbchitl 融 合表達(dá)，Bbchitl-BmChBD融合蛋白表現(xiàn)出了很強的幾丁質(zhì)結(jié)合能力，將此融合基因 (Bbchitl-BmChBD)置于真菌組成型表達(dá)啟動子gpd的下游轉(zhuǎn)化入野生型白僵菌構(gòu)建成的 重組菌，對昆蟲的致死時間比野生菌縮短23%，也比同樣是gpd啟動子啟動，但沒有ChBD 的Bbchitl的重組菌株的毒力更強。該研宄成功地將來源于昆蟲的某些遺傳組件轉(zhuǎn)入真菌 體內(nèi)使其穿透昆蟲表皮的能力得到增強（Fan Y，F(xiàn)ang W，Guo S，Pei X，Zhang Y，Xiao Y，Li D, Jin K, Bidochka MJ, Pei Y. Increased insect virulence in Beauveria bassiana strains overexpressing an engineered chitinase. Appl Environ Microbiol. 2007 ； 73(1) :295-302.) 〇
[0006] 劉振邦等報道將蘇云金芽孢桿菌晶體殺蟲蛋白CrylAc基因克隆到載體pbarGPEl 上，構(gòu)建真菌表達(dá)載體pBARGPEl-CrylAc，通過芽生孢子轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入野生型球孢白僵菌中， 獲得多拷貝轉(zhuǎn)化子；毒力測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子對馬尾松毛蟲的LC25比出發(fā)株降低5. 4倍， LD25減少7. 1倍，LT25縮短2. 2d，毒力明顯提高；喂食處理和蟲體噴霧喂食結(jié)合處理與單 純蟲體噴霧處理相比，累計致死率分別提高了 55. 6%和63. 0%，致死中時分別縮短了 4. 5d 和5. 3d。結(jié)果表明，蘇云金芽孢桿菌晶體殺蟲蛋白CrylAc基因的表達(dá)顯著提高了球孢白僵 菌的毒力。（劉振邦，任小芳，宋文婧，朱虹，黃勃，李增智。蘇云金芽孢桿菌晶體殺蟲蛋白 CrylAc基因在蟲生真菌球孢白僵菌中的表達(dá)。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，38 (5) :742-747)
[0007] 然而有趣的是，在白僵菌內(nèi)同時用gpdA啟動子及trpC終止子，表達(dá)類枯草桿菌 蛋白酶Prl與蝎毒素 AalT，卻沒有發(fā)現(xiàn)協(xié)同毒力效果，原因可能是AaIT在血腔中被Prl所 消化（Lu DD, Pava-Ripoll M, Li ZZ, Wang CS. Insecticidal evaluation of Beauveria bassiana engineered to express a scorpion neurotoxin and a cuticle degrading protease. Appl Microbiol Biotechnol. 2008,81:515 - 522) 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建一種毒殺蚊幼蟲的雙價重組球孢白僵菌，該重組 球孢白僵菌具有殺滅蚊幼蟲效果好的優(yōu)點。
[0009] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案如下：
[0010] 構(gòu)建一種毒殺蚊幼蟲的雙價重組球孢白僵菌，該重組球孢白僵菌為染色體上重組 有蝎毒基因 AaITl和蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因 Cyt2B α的球孢白僵菌，其中，所述的球 孢白僵菌為野生型白僵菌GM3. 428菌株，所述的蝎毒基因 AaITl的序列如SEQ NO. 2所示， 所述的蘇Ζ5Γ金桿囷殺蟲晶體蛋白基因 Cyt2Ba的序列如SEQ NO. 5所不。
[0011] 上述毒殺蚊幼蟲的雙價重組球孢白僵菌的制備方法包括以下步驟：
[0012] (1)依據(jù)蝎毒素 AaITl的蛋白質(zhì)序列（SEQ NO 1)，應(yīng)用球孢白僵菌偏愛密碼子優(yōu) 化編碼DNA序列（SEQ NO. 2)，并在DNA上游按前后順序分別加上EcoRI酶切位點、綠僵菌 Mcll啟動子（Mcll)、信號肽序列（SP)并在DNA下游加上XhoI位點，得到蝎毒基因 AaITl 的表達(dá)框克隆序列（SEQ N0.3);再依據(jù)蘇75Γ金桿菌殺蟲晶體蛋白Cyt2Ba的蛋白質(zhì)序列 (SEQ NO. 4)，應(yīng)用球孢白僵菌偏愛密碼子優(yōu)化編碼DNA序列（SEQ NO. 5)，并在DNA上游按 前后順序分別加上BamHI酶切位點、并在DNA下游加上EcoRI位點，得到蘇云金桿菌殺蟲晶 體蛋白基因 Cyt2Ba的克隆序列（SEQ N0.6);
[0013] (2)將步驟⑴得到的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因 Cyt2Ba進行PCR擴增，然 后將PCR產(chǎn)物與真菌表達(dá)載體pBarGPEl分別用BamHI及EcoRI雙酶切，凝膠純化回收酶切 產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并用氨芐抗性篩選出重組菌落，得到重組質(zhì) 粒pBar_Cyt2Ba ;其中，分子克隆方法參考（黃培堂等譯.[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞 爾著.《分子克隆實驗指南第三版上冊》，科學(xué)出版社，P68-71)
[0014] 所述PCR的引物為：
[0015] 上游引物序列為：5' - GGATCC丨 GCCGCCATGGAACACC-3' (SEQ NO. 7),
[0016] 下游引物序列為：5' - -GAATTQ CTAGGACTTGATGGG-3' (SEQ NO. 8)；
[0017] (3)將步驟⑴得到的蝎毒基因 AaITl的表達(dá)框克隆序列進行PCR，獲得PCR產(chǎn) 物，所述的PCR引物為：
[0018] 上游引物序列為：5' -GAATTCTGTTCATGGAACATC-3'（SEQ NO. 9)，
[0019] 下游引物序列為：5' -CTCGAGTTAGTTGATGATGG-3'（SEQ NO. 10);
[0020] (4)將步驟（3)得到的PCR產(chǎn)物與步驟⑵得到的pBar_Cyt2Ba重組質(zhì)粒分別 用EcoRI及XhoI雙酶切，凝膠純化回收酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 并用氨芐抗性篩選出重組菌落，得到重組質(zhì)粒pB