一種用于魚腥草分子鑒定的dna條形碼,引物、試劑盒和鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，特別涉及一種用于魚腥草分子鑒定的DNA條形 碼，引物、試劑盒和鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 魚腥草（HouttuyniacordataThunb)屬三白草科蕺菜屬，是宿根性多年生草本植 物。俗稱有側(cè)耳根、豬鼻孔、臭草、芩草等，因其莖葉搓碎后有魚腥味，故名魚腥草。魚腥草 不僅可以嫩莖葉和地下莖作蔬菜食用，而且全株又可鮮用或曬干入藥，它已經(jīng)被國家衛(wèi)生 部正式確定為"既是藥品，又是食品"的極具開發(fā)潛力的資源之一，日益受到人們的關注。
[0003] 因國內(nèi)外對魚腥草的需求急劇增加，使其貨源供應不足，各地曾一度出現(xiàn)混淆品， 少數(shù)不法分子摻偽作假、以偽亂真，兜售假藥以牟取暴利，加之有些參與藥材流通的人員缺 乏必要的鑒別知識或經(jīng)驗不足，使魚腥草混偽品進入商品流通渠道，嚴重影響了藥材質(zhì)量 和臨床療效。由于白苞裸蒴的外形與魚腥草很相似（圖1)，因此是目前市場上常見的魚腥 草混偽品。
[0004] 以往大都以地上莖、地下莖和葉片等形態(tài)差異和解剖學特征，有時結(jié)合理化分析 來鑒別魚腥草及其混偽品，但以上鑒定方法一是非長期從事該工作的人員不能勝任原植物 和藥品的鑒定工作；二是費時費力，且準確鑒定存在一定難度。近年來，隨著分子生物學技 術的發(fā)展，體現(xiàn)物種遺傳本質(zhì)的DNA分子已成為物種鑒定的有效分析手段。目前通過DNA 分子特征對魚腥草植物進行分類學鑒定的研宄報道缺少真?zhèn)纹返暮塑账岵町惐容^信息，不 能提供可靠的分子鑒別數(shù)據(jù)。DNA條形碼是利用基因組中一段公認標準的DNA片段來對物 種進行準確鑒定的新技術，它具有操作簡便、準確、快速的優(yōu)勢，不受樣品發(fā)育階段（葉片、 種子、花等）、藥材形態(tài)（原藥材或粉末）以及研宄者專業(yè)水平的限制，具有較強的通用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有檢測技術中存在的缺陷，從分子水平提供一種用于魚腥 草分子鑒定的DNA條形碼，引物、試劑盒和鑒定方法。本發(fā)明將加速分子標記輔助選擇在魚 腥草及其混偽品鑒定方法的應用。
[0006] 一種用于魚腥草分子鑒定的DNA條形碼，序列如SEQNO: 1。
[0007] -種用于魚腥草分子鑒定的引物，序列如下：
[0008] 正向序列F:GGAAGTAAAAGTAACAAGG，
[0009] 反向序列R:TCCTTCCGCTTAITGATATGC。
[0010] -種用于魚腥草分子鑒定的試劑盒，包括上所述的引物，以及進行PCR反應所需 的各種試劑。
[0011] PCR反應所需的各種試劑包括：10XBuffer、dNTP、MgCl2、TaqDNA聚合酶。
[0012] 所述的用于魚腥草分子鑒定的試劑盒還包括測序試劑。
[0013] -種用于魚腥草分子鑒定的方法：該方法用于區(qū)分魚腥草與白苞裸蒴，以上述的 核酸分子為引物，以待檢測樣品的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，分別擴增出642bp和 626bp大小的DNA片段，序列如SEQNO: 1和NO:2 ;將擴增出來的片段進行測序：
[0014] 魚腥草在位點4上的堿基為A，位點5上的堿基為T，位點36上的堿基為C，位點41 上的堿基為A，位點46-48上的堿基為TCG，位點56-57上的堿基都為GG，位點67-68上的堿 基為CC，位點71上的堿基為G，位點76-78上的堿基為CCA，位點84-86上的堿基為CCC，位 點96-97上的堿基為GA，位點102-103上的堿基為CG，位點107-108上的堿基為GA，位點 111上的堿基為C，在位點131上的堿基為G，位點136-138上的堿基為ATT，位點141-143 上的堿基為CCA，位點155上的堿基為A，位點159上的堿基為C，位點170上的堿基都為C， 位點176上的堿基為G，位點185-186上的堿基為CG，位點208上的堿基為C，位點376-377 上的堿基為GC，位點383-384上的堿基為GA，位點392-393上的堿基為CC，位點396-398上 的堿基為GCC，位點405-407上的堿基為GAG，位點414-415上的堿基為CT，位點423-424上 的堿基為GG，位點429-430上的堿基為GT，位點433-437上的堿基為GACGT，位點443上的 堿基為G，位點448上的堿基為A，位點452-455上的堿基為CCCT，位點462上的堿基為C， 位點465-467上的堿基為CCG，位點474上的堿基為T，位點482上的堿基為A，位點495上 的堿基都為C，位點508上的堿基為G，位點515-516上的堿基為GT，位點523-524上的堿 基為GA，位點530上的堿基為G，位點532上的堿基為A，位點539上的堿基為G，位點554 上的堿基為C，位點562-563上的堿基為AC，位點565-567上的堿基為AGC，位點572上的 堿基為T，在位點576-578上的堿基為ATA，位點581上的堿基為C，位點592上的堿基為G， 位點595上的堿基為C，位點597上的堿基為A，位點600上的堿基都為G;而白荀裸蒴在位 點4上的堿基為C，位點5上的堿基為C，位點36上的堿基為G，位點41上的堿基為G，位點 46-48上的堿基為GTC，位點56-57上的堿基都為AT，位點67-68上的堿基為GT，位點71上 的堿基為T，位點76-78上的堿基為GTG，位點84-86上的堿基為ATG，位點96-97上的堿基 為CT，位點102-103上的堿基為TA，位點107-108上的堿基為AT，位點111上的堿基為A， 在位點131上的堿基為A，位點136-138上的堿基為CCC，位點141-143上的堿基為TCC，位 點155上的堿基為C，位點159上的堿基為T，位點170上的堿基都為T，位點176上的堿基 為C，位點185-186上的堿基為AC，位點208上的堿基為T，位點376-377上的堿基為TA，位 點383-384上的堿基為CG，位點392-393上的堿基為AG，位點396-398上的堿基為TTG，位 點405-407上的堿基為CCC，位點414-415上的堿基為GG，位點423-424上的堿基為TT，位 點429-430上的堿基為CC，位點433-437上的堿基為ACGTG，位點443上的堿基為T，位點 448上的堿基為C，位點452-455上的堿基為TTGC，位點462上的堿基為T，位點465-467上 的堿基為GTA，位點474上的堿基為C，位點482上的堿基為G，位點495上的堿基都為T，位 點508上的堿基為A，位點515-516上的堿基為AC，位點523-524上的堿基為CC，位點530 上的堿基為A，位點532上的堿基為C，位點539上的堿基為A，位點554上的堿基為G，位 點562-563上的堿基為GA，位點565-567上的堿基為CCG，位點572上的堿基為G，在位點 576-578上的堿基為GCC，位點581上的堿基為T，位點592上的堿基為T，位點595上的堿 基為G，位點597上的堿基為C，位點600上的堿基都為A。
[0015]PCR體系包括 10XBuffer、0. 25mmol/LdNTP、2. 5mmol/LMgCL2、0. 2UTaqDNA聚合 酶、50ng模板DNA、引物 0? 2ymol/L。
[0016] PCR反應條件：97°C預變性4min- 30個循環(huán)：依次包括：94°C變性lmin、50°C退 火lmin和 72°C延伸lmin- 72°C延伸 7min。
[0017] 測序方法：
[0018] 采用5yL的反應體系，包括：1yL的測序mix，0. 5yL的引物（即PCR反應所用 引物），1uL的PCR純化產(chǎn)物和2. 5yL的雙蒸水；
[0019] 反應程序為：95°C預變性4min- 33個循環(huán)：依次包括96°C變性10s、50°C退火5s 和60°C延伸4min。
[0020] 測序反應產(chǎn)物經(jīng)95 %乙醇+乙酸鈉沉淀，之后用70 %乙醇、無水乙醇洗滌，干燥后 加入20yL的雙蒸水充分溶解，經(jīng)95°C變性4min后上樣，進行測序。
[0021] 與傳統(tǒng)技術相比，本發(fā)明所提供的檢測方法，①克服了現(xiàn)有技術用感官難以鑒別 魚腥草原料的真?zhèn)?；②通過建立的魚腥草DNA條形碼，能輕易地將魚腥草與白苞裸蒴區(qū)分 開來；③采用魚腥草DNA的ITS片段為目標片段，能夠準確的用于魚腥草植物的鑒定；④通 過對魚腥草DNA的ITS片段的PCR測序分析，發(fā)現(xiàn)魚腥草與白苞裸蒴在序列位點上存在穩(wěn) 定的差異，完全可以區(qū)分它們，因而本發(fā)明能準確地鑒定出魚腥草植物。本發(fā)明不僅是首先 利用基因工程中分子標記的方法鑒定魚腥草植物，而且檢測的方法簡便、可靠、速度快、不 受植株生長發(fā)育時期和環(huán)境的影響等特點，在苗期就可進行早期鑒定，大大提高了鑒定效 率。
【附圖說明】
[0022] 圖1為魚腥草植物與其混偽品白苞裸蒴的形態(tài)比較；魚腥草植物（右）與其混偽 品白苞裸蒴（左）的形態(tài)比較；
[0023] 圖2為引物對樣品材料的擴增結(jié)果。
【具體實施方式】
[0024] 以下實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0025] 實施例1:本發(fā)明方法實施的過程
[0026] (1)樣品材料的準備：分別取魚腥草和白苞裸蒴幼嫩葉片10g左右。
[0027] (2)基因組DNA的提取：利用CTAB法提取基因組DNA，將冷凍干燥的煙草葉片研 磨成粉末，加入65°C預熱的CTAB抽提液，65°C保溫45min以上，間或輕搖混勻一12000r/ min室溫離心20min后取上清液一加入等體積的氯仿：異戊醇（24 :1)，輕輕混勾15min以 上，12000r/min室溫離心20min，取上清液移入新離心管中一加入預冷的異丙醇，輕輕搖動 5111；[11，80001'/111；[11室溫離心10111；[11后去上清一沉淀用75%乙醇和10_31/1^1^(]抽提2?3 次（每次8000r/min室溫離