一株產(chǎn)植酸酶的嗜熱地衣芽孢桿菌utm102 及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，具體地，涉及一種攜帶有植酸酶基因的嗜熱地衣芽孢桿菌 菌株UTM102及其降解有機(jī)固體廢棄物以及制備生物肥料的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 在城鄉(xiāng)生活和生產(chǎn)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)固體廢棄物。如在城鎮(zhèn)生活污水處 理過(guò)程中產(chǎn)生大量的污泥，其含大量有害病菌，加之有機(jī)物含量豐富，容易腐化發(fā)臭造成嚴(yán) 重的二次污染。而農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的廢棄物，如桔桿、畜禽糞便及動(dòng)物尸體等已成為 嚴(yán)重的污染源，在某些地區(qū)已成為第一污染源。
[0003] 城鄉(xiāng)有機(jī)固體廢棄物主要的成分為木質(zhì)纖維質(zhì)物質(zhì)。木質(zhì)纖維素是由纖維素、半 纖維素與木質(zhì)素組成的晶體狀結(jié)構(gòu)，利用高溫堆肥好氧發(fā)酵以降解木質(zhì)纖維素是高效利用 有機(jī)固體廢棄物的有效方法。利用多種微生物的協(xié)同作用，使各種復(fù)雜的有機(jī)態(tài)養(yǎng)分，轉(zhuǎn)化 為可溶性、易吸收的養(yǎng)分和腐殖質(zhì)。同時(shí)堆肥所產(chǎn)生的高溫（80?KKTC )殺滅物料中的病 菌、蟲(chóng)卵。通過(guò)微生物發(fā)酵有機(jī)固體廢棄物制備生物肥料在發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)中具有重要地位， 不僅解決了廢棄物難以處理的問(wèn)題，同時(shí)變害為寶。將具有植酸酶活性，并具有多種耐高溫 的生物質(zhì)水解酶的地衣芽孢桿菌運(yùn)用于有機(jī)固廢物料的處理，并制備促生性功能生物肥料 未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)植酸酶的嗜熱地衣芽孢桿菌UTM102菌株及其應(yīng) 用。
[0005] 本發(fā)明從采自自然界溫泉底泥，利用馴化培養(yǎng)基（葡萄糖l〇g、牛肉膏3g、酵母提 取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml)在40°C，經(jīng)多代富集馴化，定向篩選后得 UTM102菌株，它具有降解有機(jī)固體廢棄物特性。該菌株已于2014年8月13日在中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào) 院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101)保藏，分類(lèi)命名為地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis，保藏號(hào)為 CGMCC No. 9508。
[0006] 本發(fā)明提供的UTM102為革蘭氏陽(yáng)性、細(xì)胞0. 8X (2. 0?3. 5)、直桿狀、單生、產(chǎn)生 近中生橢圓芽孢，孢囊膨大；在含葡萄糖蛋白胨的培養(yǎng)基上（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母 膏5g、氯化鈉5g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml，pH7. 0)菌落光滑正園、稍突、蛋殼黃色、生長(zhǎng)迅 速，30?40°C培養(yǎng)24小時(shí)后菌落直徑約2?3mm，最適生長(zhǎng)溫度40?60°C。接觸酶陽(yáng)性、 氧化酶陽(yáng)性、VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。
[0007] 利用引物為（27f) :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'經(jīng)PCR擴(kuò)增該菌株的16S rRNA基因，測(cè)序后獲得的序列見(jiàn)序 列表SEQ ID No: 1。將獲得序列提交到EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示UTM102菌株的 該基因與Bacillus Iicheniformis的相似性最高，為99. 3%，此序列是鑒定該菌株的主要 特征依據(jù)。
[0008] 利用通用引物UP-1S:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'經(jīng)PCR擴(kuò)增該菌株的gyrB基因，測(cè)序后的基因序列見(jiàn)序 列表SEQ ID N〇:2。獲得的序列提交到NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比 對(duì)，結(jié)果顯示UTM102菌株的gyrB基因序列與Bacillus Iicheniformis相似性最高，結(jié)合 所述菌株的生理生化特性為鑒別該菌株的次要特征。確定該菌株為地衣芽孢桿菌BaciIlus Iicheniformis 0
[0009] 本發(fā)明提供了一種地衣芽孢桿菌（Bacillus Iicheniformis)菌株UTM102,其保 藏編號(hào)為 CGMCC No. 9508。
[0010] 本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌UTM102具有β-葡聚糖內(nèi)切酶、纖維二糖酶、木聚糖 酶及植酸酶活性，其編碼基因見(jiàn)序列表SEQ ID Νο:3?SEQ ID Νο:6。
[0011] 本發(fā)明提供了含有地衣芽孢桿菌UTM102的菌劑。
[0012] 本發(fā)明提供了地衣芽孢桿菌UTM102或其菌劑在有機(jī)固體廢棄物的生物降解過(guò)程 中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供了一種制備含地衣芽孢桿菌UTM102的堆肥接種劑的方法，包括以下 步驟：
[0014] (1)制備發(fā)酵液：將地衣芽孢桿菌菌株UTM102活化菌種接種于葡萄糖蛋白胨的液 體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)；
[0015] (2)發(fā)酵液分裝成為液體菌劑，經(jīng)脫水干燥得到菌粉劑。
[0016] 上述方法中，步驟（1)從4°C保存的本發(fā)明菌株UTM102斜面上取少量菌苔接種至 裝有40ml含葡萄糖蛋白胨的培養(yǎng)基（葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉5g、蒸餾 水1000ml，pH7. 0)的250ml三角瓶。培養(yǎng)溫度35?40 °C，搖床轉(zhuǎn)速160-220轉(zhuǎn)/分鐘，培 養(yǎng)1?2天，OD6tltl大于1. 8時(shí)停止培養(yǎng)，此為搖瓶種子液。
[0017] 將搖瓶種子液接種至含葡萄糖蛋白胨的培養(yǎng)基（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏 5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH7. 0)的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度35?40°C，通氣量 為1:0. 1?0. 5 (v/v)，攪拌速度為100?400轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間30?48小時(shí)。當(dāng)OD6tltl 為大于1. 8停止培養(yǎng)，此為種子罐種子液。
[0018] 將種子罐種子液按0. 1?5%接種量，接種含上述培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)。培養(yǎng)溫度35?40 °C，通氣量為1:0. 2?0. 6 (v/v)，攪拌速度為60?200轉(zhuǎn)/分鐘，培 養(yǎng)時(shí)間20?40小時(shí)。當(dāng)0D_為大于1. 8時(shí)停止培養(yǎng)，此為菌株的發(fā)酵液。
[0019] 本發(fā)明提供了地衣芽孢桿菌菌株UTM102或含有其的菌劑在有機(jī)固體廢棄物堆肥 發(fā)酵中的應(yīng)用。
[0020] 所述有機(jī)固體廢棄物為下水污泥、生活垃圾、作物秸桿、動(dòng)物尸體或畜禽糞便中的 一種或多種。
[0021] 用地衣芽孢桿菌菌株UTM102或含有其的菌劑對(duì)有機(jī)固體廢棄物進(jìn)行堆肥的方 法，包括以下步驟：
[0022] (1)將相當(dāng)于總物料濕重0. 1 %?0. 5%的UTM102或其菌劑接種于有機(jī)固體廢棄 物中，混合拌勻后進(jìn)行好氧堆肥發(fā)酵；
[0023] (2)用水分調(diào)理劑將物料的水分調(diào)至含水率為45%?65%，此物料的碳氮比為 10?60:1，堆體保持氧氣含量約為8%?15% ;
[0024] (3)堆體發(fā)酵12-20天，發(fā)酵終止；剩余物料或填埋或焚燒或過(guò)篩分裝得到生物肥 料。
[0025] 上述堆肥方法中，步驟（2)的發(fā)酵進(jìn)程中最高溫達(dá)到103?105°C ;步驟（3)經(jīng) 12-20天的好氧發(fā)酵物料水分降至30?35%，廢棄物中的大部分有機(jī)物被分解，終止發(fā)酵。
[0026] 本發(fā)明提供了地衣芽孢桿菌菌株UTM102或含有其的菌劑在制備有機(jī)肥料中的應(yīng) 用。
[0027] 本發(fā)明提供了地衣芽孢桿菌菌株UTM102或含有其的菌劑在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng) 用。
[0028] 本發(fā)明從溫泉底泥中分離到一株具有植酸酶、纖維二糖酶、葡聚糖內(nèi)切酶、木 聚糖酶等活性的菌株，為利用有機(jī)固體廢棄物制備生物肥料提供了一種兼具農(nóng)作物促生效 果及降解有機(jī)固體廢棄物使其減量化無(wú)害化特性的微生物。UTM102含有植酸酶，其分泌的 植酸酶能夠?qū)⒅菜幔}）降解為肌醇和無(wú)機(jī)磷，同時(shí)釋放出與植酸（鹽）結(jié)合的其它物質(zhì) 參與到植物的能量代謝與物質(zhì)代謝過(guò)程中，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。UTM102菌株可在下水污泥、 生活垃圾、動(dòng)物尸體、畜禽糞便、農(nóng)作物秸桿等有機(jī)固體廢物中進(jìn)行好氧堆肥發(fā)酵，在有機(jī) 物料中形成穩(wěn)定的菌落生態(tài)系統(tǒng)，大量快速繁殖，有效地降解有機(jī)固體廢棄物中的有機(jī)物， 使其快速達(dá)到減量化、無(wú)害化；同時(shí)應(yīng)用本發(fā)明所制備的微生物菌劑可將有機(jī)固體廢棄物 轉(zhuǎn)化成生物肥料，此肥料中含有的大量地衣芽孢桿菌可抑制植物病原菌，對(duì)植物生長(zhǎng)能夠 起到促進(jìn)作用，可以提高作物的產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明菌株UTM102系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
[0030] 圖2為本發(fā)明菌株UTM102的顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0032] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0033] 實(shí)施例1地衣芽孢桿菌UTM102的分離與鑒定
[0034] 采取1克溫泉底泥樣品置于裝有多粒小玻璃珠及50ml無(wú)菌水的250ml三角瓶中， 40°C恒溫?fù)u床上震蕩1小時(shí)，靜置30分鐘。在無(wú)菌條件下吸取上清液lml，接入裝有50ml已 滅菌的馴化培養(yǎng)基（葡萄糖l〇g、牛肉膏3g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、IOOOml 蒸餾水）的250ml三角瓶中，40°C培養(yǎng)3天（轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘）。用同樣方法，再次吸取 Iml富集液，傳代培養(yǎng)3代。
[0035] 取培養(yǎng)3代后的菌懸液1ml，加入到9ml無(wú)菌水中，按10倍稀釋法配制成ΚΓ1，ΚΓ 2， 10_3,10_4,10_5,10_ 6,10_7的稀釋度。每個(gè)稀釋度各取0· Iml涂布于3個(gè)含有植酸鈣的鑒定 培養(yǎng)基的平板上。取0.1ml的無(wú)菌水按同法操作，作對(duì)照。40°C培養(yǎng)3天。選擇菌落分散 較好的平板，從上挑取降解圈大的單菌落。并在鑒定培養(yǎng)基上，反復(fù)劃線分離純化3次，接 種在含葡萄糖蛋白胨瓊脂的培養(yǎng)基上（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏5g、氯化鈉5g、瓊脂 15g、蒸餾水1000ml，pH7. 0)斜面培養(yǎng)至豐厚，在4°C下保存，備用。
[0036] 上述鑒定培養(yǎng)基的配方為：植酸鈣0. 1%?0. 5%、葡萄糖3?5%、NH4N03 0. 5? 0· 8%、MnS04 · 4H20 0· 002 ?0· 005%、FeS04 · 7Η200· 003 ?0· 005%、MgS04 · 7H20 0· 03 ? 0.06%、1((：10.03?0.07%、0.04%溴甲酚綠溶液1.5?2.0%卜八）、瓊脂1.5?2%， pH5. 0 ?6. 0。
[0037] 以本發(fā)明菌株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增其16S rRNA基因序列，引物為（27f): 5， -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5， -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。 PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分鐘，95 °C變性30秒，53 °C退火45秒，72 °C延伸90秒，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)其純度后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)序列表SEQ ID No: 1 所不。獲得的 16S rRNA基因序列通過(guò)EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. ezbiocloud. net/) 進(jìn)行比對(duì)，與菌株Bacillus Iicheniformis的相似性最高，同源性為99. 3%。圖1為基于 UTM102菌株及其相近菌株16S rRNA基因序列，利用Mega5. 0系統(tǒng)進(jìn)化軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化 樹(shù)（最大似然法），說(shuō)明其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與地衣芽孢桿菌最近。
[0038] 利用通用引物UP-1S:5'-G