使用序列標簽的單細胞分析的制作方法
【專利說明】使用序列標簽的單細胞分析
[0001] 交叉引用
[0002] 本申請要求2012年7月24日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/675, 254的權(quán)益，其 通過引用其全部并入。
[0003] 背景
[0004] 細胞計量術(shù)在很多醫(yī)學和研究領(lǐng)域扮演著不可或缺的角色。已發(fā)現(xiàn)基于圖 像的及流式細胞儀在這些領(lǐng)域中廣泛的用于計數(shù)細胞和測量其物理和分子性質(zhì)，例如 Shapiro，Practical Flow Cytometry, 4th Edition(Wiley_Liss，2003)。尤其是，流式 細胞術(shù)是用于對群體的大量個體細胞快速測量多個參數(shù)，使能夠獲得關(guān)于群體或其亞 群體的統(tǒng)計學上可靠信息的有力技術(shù)。該技術(shù)在一個范圍的疾病的檢測和控制中已 是重要的，尤其是血液相關(guān)的疾病，諸如造血系統(tǒng)癌癥（hematopoietic cancer)、HIV 等，例如 Woijciech，F(xiàn)low Cytometry in Neoplastic Hematology,第二版(Informa Healthcare, 2010) ;Brown 等人 Clinical Chemistry, 46:8(B): 1221-1229 (2000)。盡管有 此效用，流式細胞術(shù)具有許多缺點，包括在稀有細胞檢測（rare cell detection)中有限的 靈敏度，例如 Campana 等人 Hematol. Oncol. Clin. North Am.，23 (5) : 1083-1098 (2009);在 實際可同時測量的細胞參數(shù)數(shù)量中的局限性；及昂貴的儀器操作。
[0005] 鑒于以上，如果有克服現(xiàn)有細胞計量法的缺點、對大量個體細胞進行多參數(shù)測量 的可用的替代方法及系統(tǒng)，對很多醫(yī)學和研究領(lǐng)域?qū)⑹怯幸娴摹?br>[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明涉及用于通過為各細胞生成一個或更多個靶核酸和獨特序列標簽的融合 產(chǎn)物，進行群體的個體細胞的此種核酸的多參數(shù)測量的方法。本發(fā)明的各方面以一些實施 和應(yīng)用舉例說明，其中一些在以下概述并貫穿說明書始末。
[0008] 在一方面，本發(fā)明包括分析群體的單細胞的多個靶核酸的方法，包括步驟：(a) 提供多個反應(yīng)器，反應(yīng)器各自包含在擴增混合物中的群體的單細胞和單一同質(zhì)序列標簽 (homogeneous sequence tag),擴增混合物包含用于擴增多個中的各祀核酸的引物對；(b) 提供來自同質(zhì)序列標簽的可擴增的序列標簽；（c)擴增靶核酸和可擴增的序列標簽以產(chǎn)生 包含序列標簽的擴增子；及（d)對來自反應(yīng)器的擴增子測序以通過摻入擴增子的序列標簽 來鑒定來自群體的各細胞的靶核酸。在一些實施方案中，該方法還包括在擴增步驟之前在 反應(yīng)器中裂解單細胞的步驟。還有一些實施方案中，反應(yīng)器為通過微流體裝置制備的油包 水微團。又還有一些實施方案中，本發(fā)明的微團具有均勻的尺寸分布；例如，在一些實施方 案中，微團具有30%或更小的變異系數(shù)的體積分布。
[0009] 本發(fā)明的這些以上特點方面及其他方面以一些說明性的實施和應(yīng)用舉例說明，其 中一些顯示在附圖中并在以下的權(quán)利要求部分中描述其特征。盡管如此，以上
【發(fā)明內(nèi)容】
并 不意圖描述本發(fā)明的每一個說明性的實施方案或每一個應(yīng)用。
[0010] 附圖簡述
[0011] 圖1A顯示了本發(fā)明的方法的一個實施方案的步驟。
[0012] 圖1B顯示了來自本發(fā)明的一個實施方案的單細胞分析的數(shù)據(jù)。
[0013] 圖1C-1F顯示了同質(zhì)序列標簽的多種實施方案。
[0014] 圖1G顯示了從以珠樣式（bead format)的同質(zhì)序列標簽釋放加序列標簽的引物 (sequence tagged primer)的酶法。
[0015]圖1H顯示了利用連接酶和瓣狀（flap)內(nèi)切核酸酶附著加序列標簽的引物結(jié)合位 點至靶核酸的方法。
[0016] 圖II顯示了在圖1H中圖示的反應(yīng)的組成部分。
[0017]圖1J顯示了其中獨特序列標簽附著至靶多核苷酸的各末端的實施方案。
[0018] 圖1K圖解地顯不了用于富集含有細胞和同質(zhì)序列標簽_者的微團的微流體裝 置。
[0019] 圖2A-2C顯示了在內(nèi)部引物對具有互補的尾部時用于連接靶序列的PCA策略。
[0020] 圖3A-3C顯示了在各對內(nèi)部引物的僅1個引物具有與靶序列末端互補的尾部時用 于連接靶序列的PCA策略。
[0021] 圖4A-4C顯示了在內(nèi)部引物對具有互補的尾部及外部引物對具有用于通過PCR繼 續(xù)擴增組裝產(chǎn)物的尾部時用于連接靶序列的PCA策略。
[0022] 圖 5A-5F 顯不了祀序列的多重成對組裝（a multiplex of pairwise assemblies of target sequences)〇
[0023] 圖6A-6E顯示了用PCA將3個序列連接在一起的方法。
[0024] 圖7顯示了用于從細胞基因組DNA的隨機區(qū)段提供同質(zhì)序列標簽的實施方案。
[0025] 發(fā)明詳述
[0026] 除非有其他說明，本發(fā)明的實施可使用屬于該技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)的有機化學、分子 生物學（包括重組技術(shù)）、細胞生物學、和生物化學的常規(guī)技術(shù)和描述。此類常規(guī)技術(shù)包 括但不限于血細胞的取樣和分析、核酸測序和分析等。合適技術(shù)的具體說明可通過參考本 文以下實例獲得。盡管如此，其他相當?shù)某Ｒ?guī)步驟當然地也可使用。此類常規(guī)技術(shù)和描述 可在標準實驗室手冊諸如 Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV); PCR Primer:A Laboratory Manual ;and Molecular Cloning:A Laboratory Manual (都 來自 Cold Spring Harbor Laboratory Press) ;Ausubel,編輯，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,電子和印刷版）；等中找到。
[0027] 本發(fā)明提供了用于分析種群的個體細胞或顆粒中的多核酸的方法。在另一方面， 對各個體細胞或顆粒的核酸進行反應(yīng)以使獨特序列標簽連接至感興趣的一個或更多個細 胞核酸，之后序列標簽和靶核酸的結(jié)合物（本文中被稱作"融合產(chǎn)物"）通過高通量核酸測 序分析。即，其核酸被分析的各細胞或顆粒接收獨特的序列標簽，由此來自其的核酸可被鑒 定，并且來自其他細胞的核酸可被從其區(qū)分。如此連接的產(chǎn)物即上述的結(jié)合物在本文中稱 為"融合產(chǎn)物"。其生成后，融合產(chǎn)物被測序并制表以生成群體的各細胞或顆粒的數(shù)據(jù)，特別 地多參數(shù)數(shù)據(jù)。此類數(shù)據(jù)可包括基因表達數(shù)據(jù)、關(guān)于一種或更多種預定基因組序列（諸如 癌基因）的存在或缺失的數(shù)據(jù)、基因拷貝數(shù)的數(shù)據(jù)、或前述的組合。在一些實施方案中，此 類數(shù)據(jù)特別地包括基因表達數(shù)據(jù)，諸如源于分離自細胞細胞質(zhì)的信使RNA。分析的細胞可包 括血細胞、從組織中分解的細胞、單細胞有機體、循環(huán)腫瘤細胞等。分析的顆?？砂毎?器、外排體（exosomes)、囊泡、微泡等。在一個實施方案中，要分析的細胞和/或顆粒來自相 同的樣品或相同的生物來源，諸如（例如）患者的組織樣品。在另一個實施方案中，要分析 的細胞和/或顆?？梢允菢悠返幕旌衔锘騺碜远鄠€生物來源。在一些實施方案中，通過本 發(fā)明的方法分析的細胞缺少細胞壁。在其他實施方案中，通過本發(fā)明的方法分析的細胞為 哺乳類動物細胞，且更特別地人類細胞。
[0028] 在一些實施方案中，單序列標簽通過聚合酶循環(huán)組裝（PCA)反應(yīng)附加于多靶核 酸。在其他實施方案中，一個序列標簽附加于各靶核酸。圖1A給出了本發(fā)明一個實施方案 的概述。細胞（1〇〇)與PCA反應(yīng)混合物中的同質(zhì)序列標簽（102)結(jié)合，之后PCA反應(yīng)混合 物被分配到小的反應(yīng)體積，由此被分配到許多此類體積，每個包含單細胞和單一同質(zhì)序列 標簽。此類分配可以以下更充分公開的多種方式進行。在一些實施方案中，分配通過生成 油包水乳液（126)完成，在其中微團諸如（110)充當單細胞反應(yīng)器。微團的一部分諸如微 團（108)和（110)包含單細胞和單一同質(zhì)序列標簽。在此類微團中，靶核酸被同質(zhì)序列標 簽獨特地標記。如以下更充分的討論的，同質(zhì)序列標簽可具有多種形式。在圖1A的實施方 案中，同質(zhì)序列標簽（102)為滾環(huán)擴增反應(yīng)產(chǎn)物，即RCA擴增子，其包含加序列標簽的引物 的拷貝。放大（Blow-up) (105)把在單鏈RCA擴增子中的序列標簽表示為二進制數(shù)。在一 個實施方案中，此類加序列標簽的引物為線性寡核苷酸，各自包含在其5'末端的引物結(jié)合 位點、在其3'末端的靶特異序列、及夾在之間的序列標簽（例如圖1C中作為一個實施方案 顯示的）。此類PCA反應(yīng)物可為PCA反應(yīng)中的內(nèi)側(cè)引物或外側(cè)引物。在另一個實施方案中， 序列標簽-包含同質(zhì)序列標簽（102)的組成部分在PCA反應(yīng)中可被當作靶核酸，而非作為 引物。即，區(qū)段（154)并非是位點特異的，其還可以是對通用或連接引物特異的，從而其在 PCA反應(yīng)中沿著細胞靶核酸擴增，以產(chǎn)生包含至少一個序列標簽的融合產(chǎn)物。
[0029] 每個細胞具有和/或表達多種感興趣的核酸（104)，S卩，通過字母" &"、"13"、"，和 "W"表示的靶核酸，其可以為基因組DNA、RNA、表達的基因等。RNA靶核酸通常利用常規(guī)試劑 和技術(shù)通過逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化成DNA，所述常規(guī)試劑和技術(shù)例如如Tecott等人，美國專利 5, 168, 038中公開的。依照本發(fā)明，細胞（100)被置入（106)單細胞反應(yīng)器，其在該實例中 被顯示為油包水乳液的微團（126)，然而可使用多種單細胞反應(yīng)器，包括但不限于帶有納升 體積孔陣列的平板、微流體裝置等，如以下更充分的描述。在一方面，單細胞乳液（126)利 用微流體乳液發(fā)生器諸如由Zeng等人Ana