鑒別重唇石斛和鉤狀石斛的分子特異性標(biāo)記引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒別重唇石斛Dendrobiumhercoglossum和鉤狀石斛D.aduncum 的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該特異性引物對重唇石斛和鉤狀石斛標(biāo)本快速鑒別 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石斛是中國傳統(tǒng)名貴中草藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有滋陰養(yǎng)胃、潤肺止咳、 清熱明目之功效，另外，還有增強人體免疫力，消除腫瘤，抑制癌癥等作用。其中，重唇 石解Dendrobiumhercoglossum和鉤狀石解D.aduncum是我國僅有的兩種屬于蘭科 (Orchidaceae)石斛屬Dendrobium下的瘦軸組（SectionBreviflores)植物，主要分布于 我國云南、廣東、廣西、海南等省，被《瀕危野生植物貿(mào)易公約》（CITES)收錄，并列為重點保 護(hù)的瀕危（EN)級植物。重唇石斛和鉤狀石斛的形態(tài)學(xué)特征非常相似，主要表現(xiàn)為莖肉質(zhì)， 圓柱形或有時棒狀花序軸和花序柄細(xì)而堅實，具少數(shù)小花，萼囊寬，唇瓣比萼片短，并且凹 陷呈舟狀，不裂。并且兩者的花型、花色極其相似，均為粉紅色小花。所以，從形態(tài)學(xué)上很難 將二者相似種輕易鑒別開。因而在過去的很多年里，將兩種石斛混淆的情況經(jīng)常發(fā)生。
[0003] 對D. hercoglossum和D. aduncum這兩個相似種辨別的主要特征是宏觀上差異并 不是很顯著的花的唇瓣的顏色。但是由于兩者花朵的整體顏色非常相似，且易受生境、氣 候、生理狀況等的影響而常常導(dǎo)致主觀辨別上的偏差。而對長期保存的標(biāo)本，特別是對不在 開花期的標(biāo)本，以及古老標(biāo)本的重新鑒別，僅靠花的性狀差異更是無法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。因 此，在石斛分類研宄上，分子標(biāo)記技術(shù)成為了對石斛樣本輔助鑒別的重要手段。
[0004]ITS2是真核生物核糖體基因rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalTranscribed Spacer,ITS)上的一段順反子，位于5. 8S和28SrRNA之間。ITS2片段在物種水平的變異 較快，序列有許多的突變位點，這一特點使得ITS2序列非常適合于植物物種的分子鑒定。 近年來，ITS2序列在藥用植物鑒別研宄中得到廣泛應(yīng)用。對D.hercoglossum和D.aduncum 的ITS2區(qū)序列測序結(jié)果顯示，D.hercoglossum和D.aduncum的ITS2序列長度均為246bp〇 因此，很難利用通用ITS2引物（ITS-2F/ITS-3R)的PCR擴(kuò)增、普通電泳對兩個相似種進(jìn)行 準(zhǔn)確鑒別。通過對兩個相似種的ITS2序列比對分析發(fā)現(xiàn)二者的局部序列存在多個堿基差 異，本發(fā)明根據(jù)這一特點，設(shè)計開發(fā)了用于鑒定重唇石斛的ITS2特異性引物。本發(fā)明為兩 個相似種的分子輔助鑒別提供了可能性，對有效的鑒別和保護(hù)兩種石斛種質(zhì)資源具有非常 重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種可鑒別重唇石斛 D.hercoglossum和鉤狀石斛D.aduncum的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該引物對重 唇石斛和鉤狀石斛進(jìn)行快速鑒別的方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 一種鑒別重唇石斛D.hercoglossum和鉤狀石斛D.aduncum的分子特異性標(biāo)記引 物，其核苷酸序列如下：
【主權(quán)項】
1. 鑒別鑒別重唇石解口. Aercc的(OS5?郝鉤狀石解ft a血new?的分子特異性標(biāo)記引 物，其特征在于該引物核巧酸序列如下： 上游引物 CCF ;5' -ATCCATCCATGGATGTGTTGGC-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示； 下游引物 CCR ;5' -GCATGAATTGGGATCACCTAAT-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物在鑒別重唇石解ft Aerew/os況邸和鉤狀 石解A aotocw?中的應(yīng)用。
3. 利用如權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物進(jìn)行鑒別重唇石解和鉤狀石解的方 法，其特征在于該方法是首先提取待測石解標(biāo)本基因組DNA作為模板，W分子特異性標(biāo)記 引物CCF/CCR作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測： 若電泳結(jié)果出現(xiàn)186 bp的DNA條帶，則待測石解樣本為重唇石解ft Aercc俗/(〇5況/巧若電泳 結(jié)果未出現(xiàn)186 bp的DNA條帶，則待測石解樣本為鉤狀石解ft at/unew?。
4. 如權(quán)利要求3所述的鑒別重唇石解ft Aercc的郝鉤狀石解ft a血new?的方法， 其特征在于所述的分子特異性標(biāo)記引物CCF/CCR，其核巧酸序列如下： 上游引物 CCF ;5' -ATCCATCCATGGATGTGTTGGC-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示； 下游引物 CCR ;5' -GCATGAATTGGGATCACCTAAT-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示。
5. 如權(quán)利要求3所述的鑒別重唇石解ft Aercc俗郝鉤狀石解ft a血Z7C歴的方法， 其特征在于該方法僅適用于待測標(biāo)本為重唇石解Aercc俗7(95?況邸和鉤狀石解ft <3血new? 柄本。
6. 如權(quán)利要求3所述的鑒別重唇石解ft Aercc俗郝鉤狀石解ft a血/7C歴的方法， 其特征在于PCR反應(yīng)程序為；94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性50 s，56°C退火50 s，72°C延伸 1. 5 min, 35個循環(huán)；最后于72°C下延伸10 min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒別重唇石斛和鉤狀石斛的分子特異性標(biāo)記引物及方法。用于鑒別重唇石斛 D.hercoglossum 和鉤狀石斛 D. aduncum 的分子特異性標(biāo)記引物的上游引物CCF：如SEQ ID NO.1所示；下游引物CCR：如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明利用分子特異性標(biāo)記引物CCF/CCR，通過常規(guī)PCR方法可對兩個相似物種重唇石斛 D.hercoglossum 和鉤狀石斛 D. aduncum 進(jìn)行快速的分子鑒定，方法簡單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，時間短，半日即可完成，是形態(tài)特征辨別重唇石斛 D.hercoglossum 和鉤狀石斛 D. aduncum 的有效輔助。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104531872
【申請?zhí)枴緾N201410837817
【發(fā)明人】馮尚國, 王慧中
【申請人】杭州師范大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月29日