專利名稱：板型電泳用聚丙烯酰胺凝膠的生產(chǎn)技術(shù)及灌膠裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚丙烯酰胺凝膠的生產(chǎn)技術(shù)及其灌膠裝置，專用于臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、病毒學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)、基因工程及其他高科技生物技術(shù)領(lǐng)域生化分析中的板型電泳。
聚丙烯酰胺凝膠電泳是快速低廉的生化分析技術(shù)，聚丙烯酰胺凝膠是一種透明而不溶于水并有韌性的凝膠，是由丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺聚合而且具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，電泳時(shí)兼具有分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，從而比其他電泳的分辨力大為提高。由其為基礎(chǔ)又發(fā)展了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺遞度膠電泳等其他電泳技術(shù)。除用于蛋白電泳外還廣泛用于同工酶電泳，核酸電泳分析，還可用于測定蛋白質(zhì)核酸等分子的分子量，所以聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前使用最廣泛的生化分析技術(shù)。
現(xiàn)有的聚丙烯酰胺凝膠，一種是根據(jù)所制膠液的濃度按常規(guī)比例(見參考文獻(xiàn)人民教育出版社，1981年第一版《生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》p.109)將丙烯酰胺(Acr)-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)液、四甲基乙二胺(TEMED)液、過硫酸銨(AP)等配成新鮮的膠液，并且緩沖液是固定的，使用不便，連玻璃包轉(zhuǎn)出售，價(jià)格昂貴，另一種是由電泳操作者根據(jù)所需現(xiàn)場配制膠液，但是，在使用過程中都需現(xiàn)場制膠，而且制膠難度甚大，(1)需要專門的制膠設(shè)備，增加了電泳槽的售價(jià)。(2)灌膠時(shí)極易滲漏，一旦滲漏灌膠失敗，既損失了時(shí)間又浪費(fèi)了化學(xué)試劑。專業(yè)人員操作，滲漏率達(dá)20％左右。(3)從洗滌灌膠設(shè)備，配凝膠試劑，到成膠和預(yù)電泳要耗費(fèi)整個(gè)電泳操作過程的一半時(shí)間，也使試驗(yàn)的復(fù)雜性加大，所以使聚丙烯酰胺電泳的使用受到限制，除生化專業(yè)本科生外普通大學(xué)本科生中很少開設(shè)平板聚丙烯酰胺電泳試驗(yàn)。(4)PH酸性時(shí)凝膠不易聚合，所以做酸性電泳難度較大。鑒于以上原因，研究工作者極希望有現(xiàn)成聚丙烯酰胺凝膠以提高工作的效率，但是到目前為止國內(nèi)外尚未見到聚丙烯酰胺凝膠成品出售。
本發(fā)明的目的是提供聚丙烯酰胺成品干膠的制作技術(shù)，設(shè)計(jì)灌膠裝置，可批量生產(chǎn)板型電泳用聚丙烯酰胺凝膠的成品干膠系列，所提供的干膠在電泳操作中不需制膠程序，直接進(jìn)行電泳分析，大幅度提高生化研究工作者的工作效率，使同一試驗(yàn)節(jié)約一半以上時(shí)間。
本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為板型電泳用聚丙烯酰胺凝膠的生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于1)根據(jù)所制膠液的濃度，按常規(guī)比例量取丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺溶液、過硫酸銨溶液、四甲基乙二胺液，蒸餾水加足100份(體積)，混勻配制成膠液，2)將膠液減壓抽氣后，倒入灌膠盒1內(nèi)，灌膠盒中間平行相隔放入兩根細(xì)繩3，將膠模板2一塊一塊地平放入制膠液中，膠模板有制膠框架4及樣品槽模5的一面朝上放置，每放入一塊膠模板后，用一干凈試管刷沿膠膜板上制膠框架內(nèi)側(cè)刷一遍，再放入另一塊膠模板，3)拉兩根細(xì)繩，從而將膠模板取出灌膠盒，放置0.5～1小時(shí)待膠液凝固后，從膠模板上取出凝膠片6，4)將凝膠片浸泡于50～70％的醇類或酮類脫水劑內(nèi)3～5小時(shí)，取出將凝膠片再置于無水醇類或酮類脫水劑中浸泡2～3小時(shí)，然后將凝膠片置于30℃溫箱內(nèi)3～5小時(shí)，5)取出干膠，裝袋封口。
上述所用醇類或酮類脫水劑可以為甲醇、乙醇、丙醇或丙酮、丁酮。涉及上述生產(chǎn)技術(shù)的灌膠裝置，其特征在于灌膠盒1內(nèi)裝有膠液8，兩根細(xì)繩3平行相隔放于灌膠盒1的中間，并且繩的兩端在灌膠盒外，膠模板2平放于灌膠盒1內(nèi)、細(xì)繩3上面，膠模板向上側(cè)面粘貼有制膠框架4以及5～20個(gè)橫向單行排列的樣品槽模5，樣品槽模5位于膠模板寬度的1/5處，膠模板的四周與灌膠盒之間留有1～2mm空隙，樣品槽模5與所制成凝膠片6的樣品槽7相對應(yīng)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)1)可批量生產(chǎn)電泳用聚丙烯酰胺凝膠的成品干膠系列，如不同規(guī)格、不同厚度的凝膠，從分析用凝膠到制備用凝膠，從普通膠到梯度膠等，使用者權(quán)需將所要求的規(guī)格的干膠片浸于電泳所需的緩沖液1～1.5小時(shí)即可直接進(jìn)行電泳，不需進(jìn)行灌膠，使用單位不需準(zhǔn)備灌膠設(shè)備如框模固定架、灌膠玻璃等。
2)使用過程中，由于不需灌膠所以可避免灌膠失敗所造成的時(shí)間和試劑的浪費(fèi)和損失。
3)由于不需灌膠，也大大簡化了電泳操作程序，節(jié)約使用者大量寶貴的時(shí)間，普通中學(xué)生就可操作。本來每天只能做一次電泳試驗(yàn)現(xiàn)在每天可進(jìn)行四次試驗(yàn)，大大提高了工作效率。
4)規(guī)模生產(chǎn)后的干膠質(zhì)量和孔徑一致化了，避免了使用人員在不同時(shí)間和溫度聚膠的質(zhì)量差異，研究工作的可比性和重復(fù)性都大為提高。
5)擴(kuò)大了酸性電泳的使用范圍，酸性電泳時(shí)僅需將干膠浸泡于酸性緩沖液中就可電泳。
6)干膠制作過程中將凝膠中沒聚合的丙烯酰胺和游離的其他物質(zhì)同水一起脫出，所以使用干膠可不需預(yù)電泳，節(jié)省了時(shí)間和預(yù)電泳的試劑費(fèi)。從而大大提高生化工作的工作效率并降低了試劑成本。


圖1、聚丙烯酰胺凝膠干膠片生產(chǎn)工藝流程2、灌膠裝置示意3、膠模板2結(jié)構(gòu)示意4、凝膠片6結(jié)構(gòu)示意圖下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施例及其使用方法1、制膠設(shè)備(1)灌膠盒1，由有機(jī)玻璃制成，盒長19cm，寬15cm，高度由需一次制多少塊膠而定，10cm高的灌膠盒一次能制得20塊以上的凝膠片。
(2)膠模板2，由平板玻璃或有機(jī)玻璃制成，長18.8cm，寬14.8cm，厚0.3cm，板的一面周圍貼上1cm寬0.1cm厚的有機(jī)玻璃條構(gòu)成制膠框架4，有機(jī)玻璃條的厚度即為制好的凝膠片的厚度。選擇14條長0.7cm、寬0.2cm、厚0.05cm的塑料小條作為凝膠的樣品槽模5。這樣，制出的凝膠片6上就有14個(gè)長0.7cm、寬0.2cm、深0.05cm樣品槽7，最大加樣量可達(dá)7微升。
2、制膠試劑制備7.5％的標(biāo)準(zhǔn)膠液100升配比為含有30g/100ml Acr和0.8g/100ml Bis溶液25升，含0.14g/100mlAP溶液12.5升，TEMED溶液40μl，蒸餾水加足100升。
3、制凝膠片將配制好的制膠液混勻后減壓抽氣，抽出溶液內(nèi)的氣泡，小心倒入灌膠盒1內(nèi)，灌膠盒內(nèi)平行相隔放入兩根細(xì)繩3，細(xì)繩3的兩端在盒外，將膠模板2一塊一塊地平放入制膠液8中、細(xì)繩3上，膠膜板2有制膠框架4和樣品槽模5的一面朝上，每放入一塊膠模板2后，用一干凈的試管劇沿膠模板上制膠框架4內(nèi)側(cè)刷一遍，趕去可能存在的氣泡，再放入一塊膠模板。膠模板2放置完畢，拉兩根細(xì)繩3，從而取出膠膜板2，0.5～1小時(shí)后凝膠成型，用鑷子取出凝膠片，這樣每次可制數(shù)十塊聚丙烯酰胺凝膠片6。
4、制干膠片將凝膠片浸泡于50％的乙醇內(nèi)脫水3～5小時(shí)，此時(shí)凝膠片由透明變成了乳白色，體積縮小50％，取出凝膠片再置于無水乙醇內(nèi)繼續(xù)脫水2～3小時(shí)，此時(shí)，凝膠片已基本成為乳白色的干膠片，再將其置于30℃溫箱內(nèi)3～5小時(shí)，干膠片形成，取出裝袋封口，可長期保存，運(yùn)輸。
用甲醇、丙醇、丁醇或丙酮、丁醇及其他醇類脫水劑分別代替上述乙醇脫水劑，其他工藝相同，是普通技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。
5、使用方法本發(fā)明所提供的干膠片使電泳操作中主要省去了制膠程序，其他使用步驟與現(xiàn)有技術(shù)基本相同，所用試劑也是現(xiàn)有技術(shù)中通用的(見參考文獻(xiàn))，步驟如下(1)、恢復(fù)在一只白瓷盤內(nèi)裝300ml凝膠緩沖液，并放入一張聚酯膜(普遍投影膜)將干膠放于聚酯膜上(樣品槽面朝上)按入緩沖液中，使緩沖液浸沒干膠，1.5小時(shí)后干膠即恢復(fù)成透明凝膠。取膠時(shí)連聚酯膜一起取出，以避免凝膠破損。
(2)、電泳將凝膠連同聚酯膜放于一玻璃上，用濾紙將膠面、加樣槽內(nèi)及膠四周的緩沖液吸干，連同玻璃放于電泳槽內(nèi)。用微量加樣器吸取樣品3～5微升加于樣品槽內(nèi)，膠兩端搭上4層電極液浸濕的濾紙，加電極液于電泳槽內(nèi)就可通電。
(3)、染色及保存蛋白電泳可用考馬斯亮蘭R250和G250染色，也可用氨基黑10B染色。染色后脫色至透明時(shí)可直接進(jìn)行光密度掃描，也可泡于7％乙酸內(nèi)長期保存，或直接進(jìn)行光密度掃描。
根據(jù)發(fā)明人用干膠與鮮膠所做的豬血清蛋白區(qū)帶電泳的對比試驗(yàn)，電泳條件膠緩沖液PH7.6Tris-HCl緩沖液電極液PH8.7NaOH-硼酸緩沖液電泳時(shí)間2小時(shí)(穩(wěn)流15毫安)考馬斯亮蘭G250染色結(jié)果顯示，干膠的電泳效果比現(xiàn)灌制的鮮膠電泳效果更好，掃描峰更集中，尤其4條前白蛋白比鮮膠更明顯，鮮膠僅分出3條前白蛋白，白蛋白的峰也比鮮膠集中。
根據(jù)發(fā)明人用干膠與鮮膠進(jìn)行鵝血清酯酶區(qū)帶電泳的對比試驗(yàn)，電泳條件同上述對比試驗(yàn)，采用α-萘乙酸酯為底物，F(xiàn)ast BlueBB為顯色劑，反應(yīng)時(shí)間5分鐘，結(jié)果表明，干膠的電泳效果也比鮮膠為好，干膠的光密度峰值更集中、更高，說明干膠的區(qū)帶峰更窄，分離效果好于鮮膠。
權(quán)利要求
1.板型電泳用聚丙烯酰胺凝膠的生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于，1)根據(jù)所制膠液的濃度，按常規(guī)比例量取丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺溶液、過硫酸銨溶液、四甲基乙二胺液，蒸餾水加足100份(體積)，混勻配制成膠液，2)將膠液減壓抽氣后，倒入灌膠盒1內(nèi)，灌膠盒中間平行相隔放入兩根細(xì)繩3，將膠模板2一塊一塊地平放入制膠液中，膠模板有制膠框架4及樣品槽模5的一面朝上放置，每放入一塊膠模板后，用一干凈試管刷沿膠膜板上制膠框架內(nèi)側(cè)刷一遍，再放入另一塊膠模板，3)拉兩根細(xì)繩，從而將膠模板取出灌膠盒，放置0.5～1小時(shí)待膠液凝固后，從膠模板上取出凝膠片6，4)將凝膠片浸泡于50～70％的醇類或酮類脫水劑內(nèi)3～5小時(shí)，取出將凝膠片再置于無水醇類或酮類脫水劑中浸泡2～3小時(shí)，然后將凝膠片置于30℃溫箱內(nèi)3～5小時(shí)，5)取出干膠，裝袋封口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于所用醇類或酮類脫水劑為甲醇、乙醇、丙醇或丙酮、丁酮。
3.涉及權(quán)利要求1或2所述生產(chǎn)技術(shù)的灌膠裝置，其特征在于灌膠盒1內(nèi)裝有膠液3，兩根細(xì)繩3平行相隔放于灌膠盒1的中間，并且繩的兩端在灌膠盒外，膠模板2平放于灌膠盒1內(nèi)、細(xì)繩3上面，膠模板向上側(cè)面粘貼有制膠框架4以及5～20個(gè)橫向單行排列的樣品槽模5，樣品槽模5位于膠模板寬度的1/5處，膠模板的四周與灌膠盒之間留有1～2mm空隙，樣品槽模5與所制成凝膠片6的樣品槽7相對應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及板型電泳用聚丙烯酰胺凝膠的生產(chǎn)技術(shù)及灌膠裝置，按常規(guī)比例配制膠液，將膠液8倒入灌膠盒1內(nèi)，在盒1內(nèi)放入兩根細(xì)繩3，再將膠模板2一塊一塊地放入盒1內(nèi)，拉細(xì)繩3，取出膠模板，置0.5～1小時(shí)，膠凝固后取出凝膠片6，將凝膠片6置于50～70％醇類或酮類脫水劑中泡3～5小時(shí)，再在醇類或酮類無水脫水劑中泡2～3小時(shí)后，于30℃溫箱烘3～5小時(shí)，制成干膠。干膠在使用過程中不需制膠、預(yù)電泳等復(fù)雜程序，試驗(yàn)表明，使用效果好于鮮膠。
文檔編號C08L33/26GK1078975SQ93111559
公開日1993年12月1日 申請日期1993年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月25日
發(fā)明者陳明朗 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)