專利名稱:控制培養(yǎng)的方法及其設(shè)備的制作方法
本發(fā)明涉及控制培養(yǎng)的方法及其設(shè)備。更具體地講，是涉及控制培養(yǎng)由微生物，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞有效地生產(chǎn)如抗生素，氨基酸，酶和生理活性物質(zhì)這類代謝物的方法及其設(shè)備。
用微生物，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞生產(chǎn)上述的代謝物是常規(guī)的作法。大多數(shù)已經(jīng)采用的常規(guī)方法，是在培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)基上對種子培養(yǎng)物進(jìn)行簡單的培養(yǎng)，其生產(chǎn)力不高。
因此，本發(fā)明者們已經(jīng)對把底物和誘導(dǎo)物加入到培養(yǎng)過程中并從而改善生產(chǎn)力的培養(yǎng)方法進(jìn)行了研究。迄今還沒有報(bào)導(dǎo)過應(yīng)該將底物和誘導(dǎo)物加入到培養(yǎng)階段的工業(yè)性研究。
例如，日本公開待批專利第141796/1983已經(jīng)公開了一種生產(chǎn)代謝物，即肽的培養(yǎng)方法。然而，在這一方法中卻不可能觀察到細(xì)胞的連續(xù)生長，即在線生長。那么事實(shí)上當(dāng)然也就沒有討論加入底物和(或)相似物質(zhì)的適宜時(shí)機(jī)。日本公開待批專利第125686/1977揭示了一種培養(yǎng)酵母的方法，雖然它不是用來生產(chǎn)代謝物。這一方法包括根據(jù)總耗氧率并同時(shí)使被稱作為呼吸商的指數(shù)保持在限定范圍內(nèi)的情況來將肉湯加到培養(yǎng)物中。但是，其中并沒有采用包括加入底物和(或)類似物并監(jiān)測呼吸商變化的過程。
本發(fā)明的目的是提供一種有效地培養(yǎng)細(xì)胞以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)代謝物的方法和其設(shè)備。
在本發(fā)明的方法中，是在好氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)代謝物，其特征在于，向培養(yǎng)液中加中底物和(或)誘導(dǎo)物，確定細(xì)胞生長的終點(diǎn)和(或)代謝物的生產(chǎn)，或者根據(jù)建立在細(xì)胞培養(yǎng)物放出的二氧化碳量之上的第一參數(shù)相對于建立在細(xì)胞培養(yǎng)物耗氧量之上的第二參數(shù)的變化率來終止培養(yǎng)。
本發(fā)明中所用的細(xì)胞，可以是微生物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。把本發(fā)明應(yīng)用于培養(yǎng)基因重組的細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，將會產(chǎn)生特別顯著的效應(yīng)。
在本發(fā)明的方法中，代謝物的生產(chǎn)可在細(xì)胞培養(yǎng)之后，或在細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)進(jìn)行。從工業(yè)觀點(diǎn)出發(fā)，則優(yōu)選后一種方法。
對每一個(gè)參數(shù)的測定及對培養(yǎng)的控制，包括根據(jù)參數(shù)來開始或停止控制，最好以在線方式進(jìn)行。
以這樣的參數(shù)為基礎(chǔ)的一個(gè)典型的比率是呼吸商，此后簡稱為RQ。RQ指的是二氧化碳量與氧氣量之比，并由下列各式所代表。即RQ可由下列各式確定，其中△O2表示輸入氣與排出氣之間氧氣量的改變，相似地，△CO2代表輸入氣與排出氣之間二氧化碳量的改變，Q代表總的氣體量，Cell代表細(xì)胞數(shù)量。
RQ＝△CO2/△O2(1)RQ＝Q·△CO2/Q·△O2(2)RQ＝(△CO2/Cell)/(△O2/Cell) (3)△O2和△CO2在各式中，是基于上述數(shù)據(jù)的參數(shù)。在預(yù)先知道輸入氣中各成份濃度的情況下，則只需測定排出氣中各成份的濃度。進(jìn)而，這一比率不受RQ的限制，但能被下述方式所修飾。例如這樣的一些比率，RQ-1，RQ×A，此處A代表一個(gè)常數(shù)，RQ÷B，此處B代表一個(gè)常數(shù)，△CO2/(△CO2+△O2)，△O2/(△O2+△CO2)，(△CO2×B)/(△O2×A)和(△CO2+A)/(△O2+B)，它們均可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的加入底物和(或)誘導(dǎo)物的時(shí)機(jī)，是在以RQ為指導(dǎo)，從RQ開始上升至這一上升剛好終止的期間內(nèi)。
RQ的第二個(gè)峰，一般被認(rèn)為是判定代謝物生產(chǎn)終止的尺度，因此，優(yōu)選在這一點(diǎn)終止培養(yǎng)。
本發(fā)明的設(shè)備包括培養(yǎng)罐;在培養(yǎng)罐上有開口的輸氣管;排氣管;底物輸入管;測定輸氣管中通過氣量的第一塊氣量表;第一個(gè)氧氣分析儀;測定由培養(yǎng)罐上方經(jīng)過排出管氣量的第二塊氣量表;第二個(gè)氧氣分析儀;二氧化碳分析儀，以及計(jì)算機(jī)，用作輸入從每個(gè)表和分析儀來的信號，以及用于輸出開啟或關(guān)閉從底物輸入管到培養(yǎng)罐的管道和(或)送料控制器的信號。
應(yīng)該理解的是，在不脫離本發(fā)明的范圍之內(nèi)，可以將一些除上述以外的儀器加到本發(fā)明的設(shè)備上，例如，將二氧化碳分析儀安裝在供氣管上并裝有第一個(gè)氧氣分析儀，或者一個(gè)罐用于加入底物而另一個(gè)罐用于加入誘導(dǎo)物。在這種情況下，二氧化碳分析儀輸出的信號應(yīng)當(dāng)與其他儀表和分析儀的輸出信號一同傳送到電子計(jì)算機(jī)。另一方面，當(dāng)輸入氣的組分，即氧氣和二氧化碳的濃度已預(yù)先知道了的話，例如，使用了氧氣鋼瓶，則這些用于輸入氣的氣體分析儀就可被免去，因而就沒必要將這些分析儀的信號輸入到計(jì)算機(jī)中。這種情況也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。進(jìn)而，從在線操作的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選根據(jù)上述計(jì)算機(jī)的輸出來加入底物和誘導(dǎo)物。在這種情況下，優(yōu)選的加入這些物質(zhì)的方式，是通過泵和(或)裝在每個(gè)罐上的閥門，或裝在從每個(gè)罐連到培養(yǎng)罐的管道上的閥門。
附圖的簡要說明圖1是表示復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖2表示trp啟動(dòng)子下游方的堿基序列。
圖3表示構(gòu)造復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1的流程圖。
圖4表示RQ，細(xì)胞生長和β-半乳糖苷酶生產(chǎn)相互之間的關(guān)系。
圖5是本發(fā)明培養(yǎng)控制設(shè)備實(shí)例的示意圖。
圖6和圖7分別各自表示在體積為50升的自動(dòng)控制培養(yǎng)罐中SM發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果。
圖8和圖9表示與本發(fā)明實(shí)施例相關(guān)的實(shí)際控制培養(yǎng)的結(jié)果。
作為本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)例，以下描述的是培養(yǎng)基因重組細(xì)菌生產(chǎn)β-半乳糖苷酶(β-gal)的方法。
近來已發(fā)展出了這樣的基因重組技術(shù)，即將帶有關(guān)于生產(chǎn)有用物質(zhì)遺傳信息的基因整合到宿主微生物的載體質(zhì)粒上從而制備出復(fù)合質(zhì)粒，從而利用保留有這種復(fù)合載體的宿主微生物大量生產(chǎn)有用的物質(zhì)。這些技術(shù)已被實(shí)際用于生產(chǎn)干擾素，胰島素及類似物質(zhì)，其中以大腸桿菌(Escherichia coli)作為宿主微生物。
然而，迄今還沒有已知的用帶有所需基因的基因重組細(xì)菌工業(yè)化大量生產(chǎn)所需產(chǎn)物的方法，所以，一直急需建立一種高效培養(yǎng)基因重組細(xì)菌的方法。
在本實(shí)例中，微生物細(xì)胞內(nèi)載有或保留有包括所需基因及載體和啟動(dòng)子的復(fù)合質(zhì)粒，并且將這種能誘導(dǎo)基因表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物表達(dá)所需的基因并大量收集產(chǎn)物，在RQ在培養(yǎng)期間表現(xiàn)迅速上升時(shí)，同時(shí)加入底物和誘導(dǎo)物。
作為表達(dá)所需基因的啟動(dòng)子，可用的有trp(色氨酸)啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子(Nature，281，pp544-548，1979)，tac啟動(dòng)子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，pp21-25，1983)等等。
作為由trp啟動(dòng)子和β-半乳糖苷酶基因連接而獲得的復(fù)合質(zhì)粒，可用的有具備圖1所示結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒pTREZ1。復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1可由質(zhì)粒pTRE1和pMC1403獲得。
含有trp啟動(dòng)子的復(fù)合質(zhì)粒pTRE1，是將含有大腸桿菌的trp操縱子，trpL(引導(dǎo)肽)和trpE(鄰氨基苯甲酸合成酶)的部分終端的約500bp(堿基對)的DNA片段插入到質(zhì)粒pBR322(Gene，29，pp41-49，1984)的EcoRⅠ位點(diǎn)而獲得的。trp啟動(dòng)子的方向是質(zhì)粒pBR322的Trc(四環(huán)素抗性基因)的方向。trp啟動(dòng)子上游方的EcoRⅠ位點(diǎn)，需要充滿DNA聚合酶Ⅰ，以便僅改變啟動(dòng)子下游方的EcoRⅠ位點(diǎn)。圖2表示了下游區(qū)的trp啟動(dòng)子的堿基序列。將外來基因連接在trpE多肽基因的EcoRⅠ位點(diǎn)上，就能以與trpE多肽N末端的8個(gè)氨基酸相融合的形式表達(dá)外來基因。
另一方面，對β-半乳糖苷酶基因，可以使用質(zhì)粒pMC403(J.Bacteriol，143，pp971-980，1980)。質(zhì)粒pMC1403是將6.2Kb(千堿基對)的β-半乳糖苷酶基因(lac′Z+lacY)插入到pBR322的EcoRⅠ位點(diǎn)和SalⅠ位點(diǎn)之間而獲得的。
圖3表示了建造質(zhì)粒pTREZ1的過程，其中，β-半乳糖苷酶基因連在trp啟動(dòng)子的下游方。具有10.21Kb的復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1，可以用T4DNA連接酶將含有切自質(zhì)粒pTRE1的trp啟動(dòng)子的4.21Kb的DNA片段，與切自質(zhì)粒pMC1403的6.2Kb的β-半乳糖苷酶基因連接而成。
作為細(xì)胞內(nèi)載有包含所需基因及載體和啟動(dòng)子的雜交質(zhì)粒并且能表達(dá)所需基因的微生物，可用的有各種大腸桿菌，例如M182，HB101，C600，X1776，DH1等等。在它們當(dāng)中，將具有上述結(jié)構(gòu)的復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1引入到染色體中缺乏β-半乳糖苷酶基因的大腸桿菌M182品系(儲存于FRI，儲存號為FERM BP-816)中而獲得的用于生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的重組體，以及將復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1引入到大腸桿菌HB101(儲存于FRI，儲存號為FERM BP-815)中而獲得的生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的重組體，均受trp啟動(dòng)子的控制，而且，由于有效地利用了啟動(dòng)子的作用，所以生產(chǎn)的β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量顯著地大于已知的方法。
除了大腸桿菌之外，其他的微生物，例如酵母，枯草桿菌(Bacillus subtilis)等，當(dāng)使用了適宜的啟動(dòng)子并且把所需的基因引入其中之后，均可用作宿主微生物。
根據(jù)這個(gè)實(shí)例，含有包括所需基因，表達(dá)所需基因的載體的復(fù)合質(zhì)粒的微生物，例如，用于生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的微生物，被用來表達(dá)所需的基因，從而高效率地生產(chǎn)出其產(chǎn)物，例如β-半乳糖苷酶。為了控制重組體的培養(yǎng)，將重組體置于用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，并且將底物和(或)誘導(dǎo)物加到培養(yǎng)基中。
作為誘導(dǎo)物，對trp啟動(dòng)子可以使用3-β-吲哚基丙烯酸(IA)，對lac啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子可以使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等等。
作為底物，可以使用酪蛋白氨基酸(它是一種氨基酸混合物)，葡萄糖，色氨酸以外的氨基酸，酵母膏，或它們的混合物。其中，優(yōu)選酪蛋白氨基酸。
已知的是，在培養(yǎng)過程中加入IA，則使具有trp啟動(dòng)子的復(fù)合質(zhì)粒表達(dá)基因(Nature，291，pp503-506，1981)。這是因?yàn)橐种苹蜣D(zhuǎn)錄的阻遏物被IA滅活，從而啟動(dòng)了由RNA聚合酶合成mRNA。
本發(fā)明者們，對使用基因重組β-gal生產(chǎn)菌高效生產(chǎn)β-gal的各種控制培養(yǎng)方法進(jìn)行了研究，最后成功地生產(chǎn)了大量的β-gal，從而完成了本發(fā)明。
當(dāng)加入誘導(dǎo)物IA時(shí)，trp啟動(dòng)子開始工作。加入誘導(dǎo)物對所需基因生產(chǎn)其產(chǎn)物是非常重要的。對于加入IA的時(shí)間，Nature，vol.291，pp503-506，1981揭示了一種在培養(yǎng)開始1小時(shí)后加入IA的方法，日本公開待批專利第141796/83號揭示了一種以微生物濃度作為指示的方法。然而，這些方法對于工業(yè)化培養(yǎng)均是不夠的。
本發(fā)明者們對在這些方法中的適宜菌株生理學(xué)階段的添加IA進(jìn)行了研究，并且發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，RQ的改變與細(xì)胞的生長和β-gal的生產(chǎn)密切相關(guān)。在此處所說的RQ，是指以細(xì)胞所產(chǎn)生的CO2量除以其所耗O2量而確定的值。如圖4所示，在細(xì)胞生長階段，RQ基本保持在1mol/mol的常數(shù)上。培養(yǎng)開始后6.5小時(shí)，細(xì)胞濃度達(dá)到最大值，此時(shí)RQ迅速上升至1.25mol/mol。在該點(diǎn)，葡萄糖，即底物被消耗。開始培養(yǎng)8.5小時(shí)后，同時(shí)加入作為誘導(dǎo)物的IA15μg/ml，和作為生產(chǎn)β-gal的底物酪蛋白氨基酸2.5mg/ml。其結(jié)果是，開始培養(yǎng)的18小時(shí)后，β-gal的產(chǎn)量由4.5u/ml上升到12.3u/ml。加入IA和酪蛋白氨基酸之后，RQ又回到約1mol/mol，表示細(xì)胞幾乎不生長。這一結(jié)果表明，生產(chǎn)了β-gal并且積累于細(xì)胞內(nèi)。開始培養(yǎng)16.5小時(shí)后，RQ迅速上升?？磥砑?xì)胞對β-gal的生產(chǎn)在該點(diǎn)終止。
因此，也就揭示出以下事實(shí)，即在細(xì)胞生長期間RQ保持在1mol/mol常數(shù)上，并且在細(xì)胞停止生長時(shí)就從該處迅速上升，此時(shí)加入誘導(dǎo)物和底物，細(xì)胞生產(chǎn)其代謝物β-gal，這時(shí)的RQ為1mol/mol，當(dāng)β-gal的生產(chǎn)完成時(shí)，RQ又迅速上升。因此，在RQ的指導(dǎo)下控制培養(yǎng)，可以有效地大量生產(chǎn)代謝物。
與此相對照，先有技術(shù)，如日本公開待批專利125686/1977所揭示的以RQ為指導(dǎo)的控制培養(yǎng)，存在著這樣的缺點(diǎn)，即在喂養(yǎng)培養(yǎng)物時(shí)如過量地喂以底物，其結(jié)果會形成副產(chǎn)物乙醇，乙醇對細(xì)胞的生長有不良的影響，導(dǎo)致細(xì)胞的產(chǎn)量下降。由于在這種情況下，RQ值超過1mol/mol就警告著會有乙醇產(chǎn)生，所以底物的供給就應(yīng)該減少或暫停。此時(shí)，RQ的改變與乙醇的生成有關(guān)，但這與本發(fā)明的情況不同。在本實(shí)例中，RQ的改變與細(xì)胞的生長和代謝物的生產(chǎn)相關(guān)。即當(dāng)RQ表現(xiàn)出上升時(shí)加入底物，這與培養(yǎng)面包酵母的情況相反。在本實(shí)例中，微生物或類似的細(xì)胞有效地生產(chǎn)代謝物，這是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)代謝物期間，RQ值的變化肯定不同于培養(yǎng)面包酵母。
在本實(shí)例中，可以在細(xì)胞停止生長并RQ上升時(shí)加入葡萄糖和酪蛋白氨基酸，從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步生長，在更高的細(xì)胞濃度上繼續(xù)培養(yǎng)，然后加入誘導(dǎo)物和底物。此外，在加入誘導(dǎo)物和底物后RQ表現(xiàn)出上升時(shí)，還可加入額外的誘導(dǎo)物和底物，例如酪蛋白氨基酸，從而獲取更大量的細(xì)胞代謝物。
當(dāng)基因重組細(xì)菌帶有非trp的對于表達(dá)載體的啟動(dòng)子，例如lac(乳酸)啟動(dòng)子時(shí)，則以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)物。用微生物生產(chǎn)代謝物，均可用相同的控制方式，只是要用不同的底物和誘導(dǎo)物，但對基因重組細(xì)菌，動(dòng)物細(xì)胞及植物細(xì)胞就不同了。
圖5表示了本實(shí)例所需的典型設(shè)備。培養(yǎng)基和培養(yǎng)種子放入培養(yǎng)罐1中，基因重組細(xì)菌在其中培養(yǎng)，并且通過導(dǎo)管7向培養(yǎng)罐1中吹入空氣，以攪拌器2攪拌培養(yǎng)汁。在此期間，用計(jì)算機(jī)4對來自安裝在導(dǎo)管7上的氣表5和氧氣分析儀6的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定入口處的氧氣量，同時(shí)，對出口處的氧氣和二氧化碳量，則以同樣的方式，用計(jì)算機(jī)在來自安裝在導(dǎo)管13上的氣表10，氧氣分析儀11和二氧化碳分析儀12的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上加以確定，進(jìn)而算出RQ。當(dāng)RQ表現(xiàn)出迅速上升時(shí)，則計(jì)算機(jī)4就發(fā)出信號打開底物添加泵8，這樣，就將IA和酪蛋白氨基酸由底物罐3通過導(dǎo)管9加入到培養(yǎng)罐1中。當(dāng)RQ再次表現(xiàn)出迅速上升時(shí)，則終止培養(yǎng)，將細(xì)胞從培養(yǎng)汁中回收出來，研碎分離，對積累于其中的β-gal進(jìn)行純化。
當(dāng)供給的不是空氣而是純氧時(shí)，就不需要氧氣分析儀6，當(dāng)供給的是含二氧化碳的氣體時(shí)，優(yōu)選再加一個(gè)二氧化碳分析儀。
作為氧氣分析儀，可使用膜類氧氣敏感器，作為二氧化碳分析儀，則可以使用紅外吸收分析儀，作為流量表，可用熱質(zhì)流量表。
優(yōu)選的底物舉例有葡萄糖，酪蛋白氨基酸和它們的混合物。
當(dāng)?shù)孜?養(yǎng)料)和誘導(dǎo)物一起使用時(shí)，則優(yōu)選同時(shí)加入這兩種物質(zhì)。
作為本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)例，以下描述了用灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)生產(chǎn)作為其代謝物的抗生素的方法，類似于鏈霉素(SM)的發(fā)酵生產(chǎn)。
對在SM發(fā)酵過程中所添加的各種底物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)葡萄糖更有效。然后，又研究了使用培養(yǎng)瓶添加葡萄糖的適宜時(shí)期。表1給出其結(jié)果。
在第一、第二和第五天向培養(yǎng)物中加入葡萄糖，每次增加10g/l。對每一種情況均沒有觀察到顯著的效應(yīng)。
然后，基于在SM的生產(chǎn)達(dá)到最大之后加入葡萄糖可能會有效這一假設(shè)，則在培養(yǎng)的第2.5天，以5，10和20g/l這種增加的量加入了葡萄糖。表2給出其結(jié)果。
表2指出，在培養(yǎng)的第2.5天，以10g/l的增加量加入葡萄糖，則使SM的產(chǎn)量增加1.5倍。
圖6(a)-(c)和圖7(a)-(d)表示了發(fā)酵生產(chǎn)SM的結(jié)果，發(fā)酵中使用了包括50升培養(yǎng)罐的自動(dòng)控制培養(yǎng)設(shè)備以檢驗(yàn)何時(shí)應(yīng)該加入葡萄糖。當(dāng)培養(yǎng)的第二天所生產(chǎn)的SM達(dá)到峰值時(shí)，耗氧率及二氧化碳生成率均迅速下降。此時(shí)的葡萄糖濃度為10g/l，這表明有葡萄糖起始量的50%仍然保留著。然而，觀察到的這種現(xiàn)象，可能是因?yàn)镾M生產(chǎn)細(xì)菌的代謝由生產(chǎn)SM的方向上轉(zhuǎn)換到其他方向了。本發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)了這種耗氧率和二氧化碳生成率的迅速改變。因此，在這些改變的指導(dǎo)下加入葡萄糖，就使SM的生產(chǎn)力得到了改善。
從供入氣的氧氣量(mol/h)減去排出氣中的氧氣量(mol/h)來確定耗氧率，從排出氣中的二氧化碳量(mol/h)減去供入氣中的二氧化碳量(mol/h)來確定二氧化碳生成率。當(dāng)供入氣為常量時(shí)，則排出氣中氧氣和二氧化碳濃度的改變，就可用作指示參數(shù)。
糖類，例如糖，和氨基酸，可以作為類似于葡萄糖的底物加入。
在實(shí)施本實(shí)例時(shí)，應(yīng)該先做一個(gè)試驗(yàn)培養(yǎng)，使用與實(shí)際培養(yǎng)時(shí)所用相同的底物，菌株或細(xì)胞，以確定在特定條件組合的情況下，耗氧率和(或)二氧化碳生成率在哪一點(diǎn)上迅速改變，并且基于這一預(yù)先試驗(yàn)的結(jié)果，可以確定實(shí)際加入的時(shí)間。
以下給出的是分別對應(yīng)于上述實(shí)例的實(shí)施例。
實(shí)施例1菌株帶有復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1的大腸桿菌菌株HB101。該菌株源自大腸桿菌K-12，是已知的基因重組的典型宿主。它的基因型為F-(缺失F因子)，hsd S20(r-B，m-B)，recA 13 ara-14，proA2，lacY 1，galK 2，rpsL 20(Srm)，xyl-5，mtl-1，supE 44和λ-(缺失λ噬菌體)。
培養(yǎng)基M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基(pH7.0)，含有1克NH4Cl，6克Na2HPO4，3克KH2PO4，5克NaCl，0.1克MgSO4·7H2O，15毫克CaCl2·2H2O，5克葡萄糖，2.5克酪蛋白氨基酸，0.1克硫胺素，0.1克脯氨酸和1升蒸餾水。此后，進(jìn)而加入50μg/ml氨芐青霉素于培養(yǎng)基中，從而選擇性地僅使帶有復(fù)合質(zhì)粒的大腸桿菌菌株生長。
培養(yǎng)條件在8個(gè)容積為500毫升并且其中裝有50毫升M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基的搖瓶中，接種帶有復(fù)合質(zhì)粒的大腸桿菌菌株〔儲存在FRI，儲存號FERM BP815;E.coli HB101(pTREZ1)〕，在37℃以每分鐘115次振動(dòng)，振距7cm的搖振條件過夜培養(yǎng)。以100毫升細(xì)胞培養(yǎng)物作為培養(yǎng)種子，接種到容積為5升并含有2升M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基的4個(gè)罐式發(fā)酵器中，在其中培養(yǎng)。向其中加入兩滴消泡劑(Leocon 1750W;mfd.Lion Co，Ltd的產(chǎn)品)。細(xì)胞過夜培養(yǎng)，溫度為37℃，pH7.0，以每分鐘600轉(zhuǎn)機(jī)械攪拌，通氣率為每分鐘2升。將8升這種培養(yǎng)汁接種到容積為50升的自動(dòng)控制培養(yǎng)設(shè)備中，加入M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基使總體積為30升。加入與上述相同的消泡劑，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，溫度為37℃，pH為7.0，通氣率為每分鐘6升，溶氧濃度為3mg/l，以每分鐘150-400轉(zhuǎn)機(jī)械攪拌。
結(jié)果如圖6所示，培養(yǎng)開始后約4小時(shí)，RQ迅速上升。然后加入IA15微克/毫升，酪蛋白氨基酸2.5毫克/毫升。當(dāng)RQ表現(xiàn)出上升時(shí)，細(xì)胞濃度為2.69g/l，β-gal的量為4.3u/ml。開始培養(yǎng)13小時(shí)后，RQ再次上升。此時(shí)，細(xì)胞濃度為2.66g/l，β-gal的量為8.3u/ml。這就是說，當(dāng)β-gal幾乎增長一倍時(shí)細(xì)胞的濃度變化很小。
這些結(jié)果表明，在RQ的指導(dǎo)下加入IA和酪蛋白氨基酸可以明顯地提高β-gal的產(chǎn)率。
在RQ達(dá)到第二個(gè)峰后可以終止培養(yǎng)。
作為帶有復(fù)合質(zhì)粒pTREZ1的菌株，來自大腸桿菌K-12的并在染色體上缺失β-gal基因的大腸桿菌M182，以及基因型由△(lac IPOZY)X74，galK，galU，StrA所代表的菌株均可使用。在這種情況下，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件均與上述相同，不同的是用帶有復(fù)合質(zhì)粒的大腸桿菌菌株〔E.coli M182(pTREZ1)，儲存于FRI，儲存號為FERM BP-816〕代替了上面的大腸桿菌。
實(shí)施例2菌株灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)HUT2247。
培養(yǎng)基成分25克葡萄糖，2克(NH4)2SO4，0.4克KH2PO4，1克NaCl，6克K2SO4，0.2克MgSO4·7H2O，0.01克FeSO4·7H2O，0.05克ZnSO4·7H2O，7克L-天冬酰胺，2克CaCO2和1升蒸餾水(pH7.0)。
培養(yǎng)條件30升培養(yǎng)基加到容積為50升的培養(yǎng)罐中，然后向其中加入600毫升預(yù)先經(jīng)48小時(shí)搖振培養(yǎng)的培養(yǎng)種子。進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，溫度為28℃，pH為6.7，同時(shí)保持入口處的氣量為8升/分。機(jī)械攪拌率改為每分鐘140-245轉(zhuǎn)，因而使溶氧濃度為4.5mg/l。
結(jié)果如圖7所示，在培養(yǎng)的開始階段，RQ保持在0.5mol/mol，在第一天后半天開始上升，在開始培養(yǎng)后2.2天達(dá)到最大值。然后向其中加入1升葡萄糖(300g/l)作為底物。此時(shí)，細(xì)胞濃度達(dá)到最大值，仍保留有11.5g/l的葡萄糖。此時(shí)鏈霉素的產(chǎn)率為155mg/l，當(dāng)加入葡萄糖培養(yǎng)4天后，產(chǎn)率為265mg/l(即是前者的1.7倍)。培養(yǎng)的第4天后，由于細(xì)菌分裂而使RQ下降，大致上與培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗相符合。
因此，在RQ指導(dǎo)下控制發(fā)酵，可以有效地生產(chǎn)鏈霉素。
如上所述，本發(fā)明對于高效率工業(yè)化培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)代謝物是有效的。
權(quán)利要求
1.一種控制培養(yǎng)方法，其中在好氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)代謝物，其特征步驟在于以細(xì)胞放出的二氧化碳量為基礎(chǔ)確定第一個(gè)參數(shù)；以細(xì)胞的耗氧量為基礎(chǔ)測定第二個(gè)參數(shù)；計(jì)算第一參數(shù)與第二參數(shù)的比率；并且在所述比率之改變的指導(dǎo)下控制培養(yǎng)，所述的控制培養(yǎng)步驟包括，至少向培養(yǎng)汁中加入一次底物的步驟，判定細(xì)胞生長的終點(diǎn)，終止培養(yǎng)，判定代謝物生產(chǎn)的終點(diǎn)，對加入底物以及停止培養(yǎng)進(jìn)行控制。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的控制培養(yǎng)方法，其中所說的比率是呼吸商。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的細(xì)胞是微生物細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的控制培養(yǎng)方法，其中在所述加入底物的步驟中，將誘導(dǎo)物與所述的底物一同加入到所述的培養(yǎng)汁中。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的控制培養(yǎng)方法，其中，在所述的加入底物的步驟中，是在所述呼吸商開始上升直至下降的期間內(nèi)加入底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的底物和誘導(dǎo)物是在所述呼吸商開始上升直至下降的期間內(nèi)加入。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的控制培養(yǎng)步驟包括，將誘導(dǎo)物與底物一同加入到培養(yǎng)汁中的步驟，以及判定細(xì)胞生長的終點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的控制培養(yǎng)步驟包括，在所述呼吸商開始上升直至上升剛剛結(jié)束的期間內(nèi)，將一種底物和誘導(dǎo)物加入到培養(yǎng)汁中，以及確定細(xì)胞生長的終點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的控制培養(yǎng)步驟包括，將誘導(dǎo)物與所述的底物一同加入到培養(yǎng)汁中的步驟，以及控制培養(yǎng)的終止。
10.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的控制培養(yǎng)步驟包括，至少加入誘導(dǎo)物和底物其中之一的步驟，以及控制培養(yǎng)的終止。
11.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的微生物細(xì)胞是基因重組細(xì)菌細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的測定所述第一參數(shù)和第二參數(shù)的步驟，控制加入底物的步驟以及培養(yǎng)的終止是在線進(jìn)行的。
13.一種控制培養(yǎng)的方法，其中在好氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)代謝物，其特征步驟在于測定細(xì)胞排出的二氧化碳量;測定細(xì)胞的耗氧量;以所述二氧化碳和氧氣的測定值計(jì)算出呼吸商;并且在所述呼吸商開始第一次迅速上升直至第一次迅速上升剛剛結(jié)束之間，加入至少一種底物和誘導(dǎo)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的控制培養(yǎng)方法，其中，以對在所述期間之后出現(xiàn)的所述呼吸商的第二次迅速上升的測定為基礎(chǔ)來終止培養(yǎng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的控制培養(yǎng)方法，其中所述的測定二氧化碳的步驟和所述測定氧氣的步驟包括，對向細(xì)胞培養(yǎng)物在其中起作用的培養(yǎng)罐中導(dǎo)入的氣體的氣流速率，二氧化碳和氧氣濃度的測定，以及對從所述培養(yǎng)罐中排出氣體的氣流速率，氧氣和二氧化碳濃度的測定。
16.一種用于控制好氧培養(yǎng)的設(shè)備，包括用于包含培養(yǎng)汁于其中并使之在其內(nèi)起作用的培養(yǎng)罐(1)，向所述培養(yǎng)罐(1)供入氧氣的供氧裝置(7)，從所述培養(yǎng)罐(1)中排放出二氧化碳的裝置(12)，測定細(xì)胞放出的二氧化碳量的裝置(10，11，12)，測定細(xì)胞所耗氧氣量的裝置(5，6，10)，其特征在于，用于以所述測定的二氧化碳量和氧氣量為基礎(chǔ)測定呼吸商的裝置(4)，以及參照呼吸商變化控制所述添料的裝置(3，8，9)。
專利摘要
一種控制培養(yǎng)方法，其中細(xì)胞好氧培養(yǎng)生產(chǎn)代謝物，其特征在于，向培養(yǎng)汁中加人底物和(或)誘導(dǎo)物，用以細(xì)胞所放出的二氧化碳量為基礎(chǔ)的第一參數(shù)對以細(xì)胞所耗氧氣量為基礎(chǔ)的第二參數(shù)之比率的變化為指導(dǎo)，判定細(xì)胞生長的終點(diǎn)和(或)代謝物的產(chǎn)量或終止培養(yǎng)。其中的比率例如是呼吸商。
文檔編號C12R1/19GK86101928SQ86101928
公開日1986年9月24日 申請日期1986年3月25日
發(fā)明者清水范夫, 福真一, 西村信子, 緒田原蓉二, 住谷知明 申請人:株式會社日立制作所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan