專利名稱:一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物細(xì)菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種支氣管敗血波氏桿菌 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因(aroA)缺失菌株、基因缺失疫苗及應(yīng)用。
背景技術(shù)
豬萎縮性鼻炎(Atroptic Rhinitis, AR)是由支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella Bronchiseptica,Bb)和產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)共同作用引 起的一種豬呼吸道傳染性疾病，該病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，世界動物衛(wèi)生 組織0ΙΕ]和我國將其列為B類或乙類動物疫病。豬萎縮性鼻炎在臨床上以出現(xiàn)鼻炎、鼻甲 骨萎縮和生長性能下降為特征。研究表明，支氣管敗血波氏桿菌是引起豬萎縮性鼻炎的原 發(fā)性病原菌，單獨的Bb常常造成隱性感染，發(fā)病豬生長緩慢，育肥延遲，極大地降低了生產(chǎn) 效率。更為嚴(yán)重的是，Bb感染豬后，可入侵并滯留在肺泡巨嗜細(xì)胞內(nèi)并對巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì) 胞毒性作用，在感染后7小時內(nèi)就可使其活性喪失90%以上，這樣就為其他病原菌入侵提 供了條件，導(dǎo)致更為嚴(yán)重的進(jìn)行性萎縮性鼻炎或者復(fù)雜的呼吸道感染。
支氣管敗血波氏桿菌除了導(dǎo)致豬萎縮性鼻炎外，該菌還能廣泛地感染多種哺乳動 物，如兔，狗和靈長類動物，具有一定的公共衛(wèi)生意義。雖然在多數(shù)情況下Bb的感染僅限于 上呼吸道，而且處于隱形感染狀態(tài)，故Bb的感染常常被忽視。但是Bb能夠抑制呼吸道的局 部免疫，并造成呼吸道屏障功能的破壞，為其他病原的入侵提供了機(jī)會。近年的流行病學(xué)調(diào) 查發(fā)現(xiàn)Bb能夠感染某些特定人群，如老人，免疫缺陷者，產(chǎn)生類似于百日咳桿菌(該菌也屬 于波氏桿菌屬)引起的百日咳癥狀。所以人們對Bb的預(yù)防控制日益重視。
預(yù)防Bb感染最有效的方法是免疫接種。支氣管敗血波氏桿菌全細(xì)胞滅活疫苗獲 準(zhǔn)在各國應(yīng)用已有30多年了，通過免疫母豬經(jīng)初乳提供的保護(hù)顯然已降低了這一細(xì)菌對 養(yǎng)殖生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)影響。然而，現(xiàn)有的滅活疫苗不足以抵御Bb在呼吸道，尤其是上呼吸道的 定殖。因為通過肌肉免疫的滅活疫苗雖然能夠激起很好的體液免疫，產(chǎn)生高滴度的抗體，但 是IgG類型的抗體不能到達(dá)肺泡表面和上呼吸道，導(dǎo)致定殖在呼吸道的波氏桿菌不能有效 的被清除。而Bb在鼻腔和呼吸道的長期定殖將導(dǎo)致萎縮性鼻炎和慢性肺炎等疾病，并增加 其他疾病繼發(fā)感染的風(fēng)險。正是由于現(xiàn)有的豬萎縮性鼻炎疫苗的這種缺陷，世界各國學(xué)者 都致力于豬萎縮性鼻炎基因工程疫苗的研究，力求獲得一種更安全、高效的新型疫苗。
細(xì)菌弱毒疫苗是現(xiàn)代疫苗的發(fā)展方向之一。使用安全性高、致弱的活細(xì)菌作為疫 苗有很多優(yōu)點首先它能直接進(jìn)入豬的呼吸系統(tǒng)，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫、體液免疫 和細(xì)胞免疫；二是它可以通過滴鼻或鼻腔噴霧等方式接種，操作簡便易行；三是免疫原性 好，一次免疫就能產(chǎn)生很好保護(hù)水平；四是該弱毒菌株能夠?qū)Ξ愒吹闹夤軘⊙ㄊ蠗U菌 產(chǎn)生保護(hù)；五是生產(chǎn)方便，快速，經(jīng)濟(jì)，適合大面積推廣；F.它可以攜帶較大的基因片斷，易 于構(gòu)建多價基因工程疫苗，達(dá)到一種疫苗預(yù)防兩種或者多種疾病的目的。目前國內(nèi)外使用 的使細(xì)菌致弱的方法主要有缺失細(xì)菌的主要毒力基因，或者缺失細(xì)菌與營養(yǎng)代謝有關(guān)的 基因。相對于通過缺失毒力基因至弱的方法，缺失營養(yǎng)代謝基因有以下幾個好處i)缺失了營養(yǎng)代謝基因的弱毒菌株在動物體內(nèi)只能有限繁殖，水平傳播能力極度下降，這樣確保了弱毒疫苗的安全性；ii)缺失毒力基因會導(dǎo)致免疫原性下降，而缺失營養(yǎng)基因往往不影 響毒力基因的表達(dá)。
目前國外已有學(xué)者開始對支氣管敗血波氏桿菌作為弱毒活疫苗進(jìn)行研究，但迄今 為止還沒有一個較為成熟的產(chǎn)品問世。本發(fā)明考慮到芳香族生物合成途徑是革蘭氏陰性菌 和陽性菌共有的途徑，aroA編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸合成酶，該酶催化芳香族氨 基酸的合成，而哺乳動物不具備該合成途徑，故細(xì)菌從宿主體內(nèi)獲得這些化合物的可能性 極小，使得aroA缺失株的體外培養(yǎng)存在營養(yǎng)缺陷，在宿主體內(nèi)只能有限繁殖，從而使毒力 減弱，但其仍保留良好的免疫保護(hù)性。因此，我們首先克隆aroA及其上、下游基因，構(gòu)建重 組自殺性質(zhì)粒，利用氯霉素抗性和PCR進(jìn)行aroA基因缺失株的篩選，并對其遺傳穩(wěn)定性、毒 力、對豬的致病性和免疫原性進(jìn)行研究。該疫苗菌株不攜帶任何外源基因、抗生素抗性基因 或者基因轉(zhuǎn)移原件，所以菌株對動物、環(huán)境和人均是安全的，且具有很好的免疫效果。以自 行構(gòu)建的基因工程菌株研制具有我國知識產(chǎn)權(quán)的基因工程弱毒疫苗并應(yīng)用于生產(chǎn)，將是我 國應(yīng)對當(dāng)今農(nóng)業(yè)所面臨的挑戰(zhàn)，提高競爭力的措施之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一株支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株；
本發(fā)明的第二個目的是利用該支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株制備豬支氣管 敗血波氏桿菌基因缺失疫苗；
本發(fā)明的第三個目的是支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株在制備支氣管敗血波 氏桿菌基因缺失疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
利用基因工程技術(shù)先將支氣管敗血波氏桿菌野生菌株HH0809(該菌株是豬源支 氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchis印tica)HH0809，于2007年9月18日保藏在中國 典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO :M207148 ；參見申請人在前的發(fā)明專利 申請“一種表達(dá)豬源支氣管敗血波氏桿菌fhaB和prn基因片段的重組豬霍亂沙門氏菌株、 疫苗及應(yīng)用”，專利申請?zhí)柼?00710053386. 2，公開號CN101157907)的一個主要芳香烴氨 基酸代謝基因aroA完全缺失后，使整個芳香基團(tuán)的生化代謝途徑被阻斷。將aroA基因的 上游和下游各SOObp的序列通過分子克隆技術(shù)克隆至克隆載體上，通過酶切位點拼接在一 起，構(gòu)成重組所必需的上下游同源臂。將連接在一起的上下游同源臂片段轉(zhuǎn)移至自殺性載 體PRE112，(徐引弟，郭愛珍，陳煥春.豬霍亂沙門氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的構(gòu)建 及鑒定，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2008，16 (2) 196-201)上。然后將重組有上下游同源臂自殺性 載體通過結(jié)合轉(zhuǎn)移至支氣管敗血波氏桿菌野生菌株HH0809中，通過自殺性載體pREl 12上 的氯霉素抗性基因和針對aroA基因的PCR方法來篩選同源臂和同源基因的第一次同源重 組(單交換)。篩選所得單交換克隆通過對氯霉素抗性的消除和PCR驗證來篩選aroA缺失 的雙交換菌株(QH0814AarOA)。申請人將篩選所得aroA基因缺失菌株命名為支氣管敗血 波氏桿菌(Bordetella bronchis印tica) QH0814 Δ aroA。該基因缺失菌株于2008年1月 24日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為 CCTCC N0:M208018。本發(fā)明制備的一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失株氨基酸代謝基因aroA被缺失，導(dǎo)致其毒力大大降低，并且在環(huán)境中只能有限存在，因而具有很高的安全性。 而且由于營養(yǎng)基因缺失菌株仍然能表達(dá)所有的毒力基因，因此具有很好的免疫原性。
本發(fā)明的主要優(yōu)點是
1、本發(fā)明所用的材料為支氣管敗血波氏桿菌野生致病菌株HH0809，具有全部的毒 力因子和其他免疫原性良好的抗原。因此，用該致病菌株進(jìn)一步構(gòu)建的aroA基因缺失菌株 QH0814 Δ aroA研制成的弱毒疫苗對豬免疫具有很強(qiáng)的針對性，有廣闊的市場應(yīng)用前景。
2、本發(fā)明支氣管敗血波氏桿菌因缺失菌株不含抗性標(biāo)記的疫苗菌株，完全符合在 我們國家疫苗生物安全性要求。
3、支氣管敗血波氏桿菌芳香烴氨基酸代謝途徑中的重要基因aroA完全缺失后， 獲得的aroA缺失株毒力大大降低而其免疫原性未發(fā)生改變，可以保護(hù)多種異源野毒菌株 攻擊。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明構(gòu)建支氣管敗血波氏桿菌aroA缺失株所用的下游 同源臂的序列
序列表SEQ ID NO 2是本發(fā)明的來源菌株支氣管敗血波氏桿菌野生菌HH0809中 缺失的aroA基因序列。
序列表SEQ ID NO 3是本發(fā)明構(gòu)建aroA缺失株所用的上游同源臂的序列。
圖1 是本發(fā)明中用于構(gòu)建支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失株的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pRE Δ aroA的物理圖譜。
圖2 是本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的鑒定其中
圖2A 是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRE AaroA的酶切鑒定結(jié)果，圖中M(Ieft) =DNA Marker(DL15000)M(right) :DNA Ladder(DL2000)1-3 :pREΔaroA/Kpnl+SacL·
圖 2B 是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的 PCR鑒定，M :DNA Ladder (DL2000) 1 :ddH20 control 2-4 :PCR product ofpREAaroA。
圖3 是本發(fā)明制備的pRE Δ aroA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建的流程圖。
圖4 本發(fā)明所使用的基因同源重組原理示意圖
圖5 是本發(fā)明中的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒整合至基因組的PCR鑒定；圖中M :DNA Ladder (DL 2,000) ； 1 :ddH20control· 2 :parent strain HH08093 Δ aroA mutant conjugants 4: plasmid pREAaroA。
圖6 是本發(fā)明中的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失株的PCR篩選，圖中M :DNA Ladder(DL 15000)；
1 :ddH20 control ；
2 :parent strain HH08093、4 : ΔaroA mutants
圖7:是本發(fā)明中的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失株QH0814 Δ aroA的遺 傳穩(wěn)定鑒定；圖中 M(Ieft) =DNA Ladder(DL 15000) ；M(right) :DNA Ladder(DL 2000)； 1 :ddH20 control ;2 :parent strainHH0809；3 Δ aroA mutant conjugants；4-8 :five generations of Δ aroA mutant
圖8 本發(fā)明構(gòu)建的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失株QH0814 AaroA的生長曲線具體實施方式
以下結(jié)合
和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不是限制本發(fā)明。
實施例1
1、aroA弓丨物設(shè)計和PCR擴(kuò)增
根據(jù)已報道的支氣管敗血波氏桿菌RB50株全基因組序列(參照GenBank登錄號 為AF315119的基因序列)設(shè)計兩對引物(所有引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合 成)分別擴(kuò)aroA基因的上游同源臂(SEQN0. 3)和下游同源臂(SEQ NO. 1)，擴(kuò)增片段大小分 別為863bp和900bp，上游臂兩端分別設(shè)計KpnI和BamHI酶切位點，下游臂兩端分別設(shè)計 BamHI和SacI酶切位點。所述引物序列如下Cl 5' -TGCGGTACCTAGGTTGGAATCCATTTGGC-3' (Kpn I)
C2 5'-TAAGGATCCCCATGGCTATTTCCGCATCC-3' (BamH I)
引物Cl和C2擴(kuò)增上游同源臂863bp
Tl5'-TGTGGATCCTGGAATCCTTGCGCCAATTG-3'(BamH I)
T2 5‘-TAAGAGCTCTCCGGCGCTGCCATATTGTT-3‘ (Sac I)
引物Tl和T2下游同源臂900bp
2.支氣管敗血波氏桿菌aroA基因上游同源臂和下游同源臂的克隆
將改良的TSA(即胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基，購自美國BD公司，以該培養(yǎng)基為基本成 分，添加體積為10%的小牛血清)融化，冷卻至50°C，倒于培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，置37°C 溫箱內(nèi)培養(yǎng)2-3h至水汽烘干。將凍干的HH0809(參見本說明書前面的《
發(fā)明內(nèi)容
》部分所 述的菌株來源的描述)接至烘干培養(yǎng)皿中過夜培養(yǎng)。第二天挑取單菌落接種于改良TSB(即 胰蛋白大豆培養(yǎng)基，購自美國BD公司，以該培養(yǎng)基為基本成分，添加體積為10%的小牛血 清)培養(yǎng)基中，37°C 200r/min培養(yǎng)7-10h提取細(xì)菌的基因組。
取ImL支氣管敗血波氏桿菌菌液離心，用200yL滅菌水重懸，加入200 μ L 2 X Kawasaki Buffer (IOmLBuffer 中包含 400 μ L IMTris-HCl (ρΗ8. 3), 15 μ L 2Μ MgCl2, 125 μ L 4Μ KCiaOOyL Tween-20)和 1 μ L 濃度為 20mg/mL 的蛋白酶 K，56°C水浴過夜(超 過8h)，次日95°C水浴15min以滅活蛋白酶K，冰上冷卻lOmin，12000rpm離心lOmin，上清 是支氣管敗血波氏桿菌基因組DNA，即為PCR模板。短期保存置于4°C，長期保存分裝放 于-20"C。
擴(kuò)增反應(yīng)在50 μ L的體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系如下模板DNA 5 μ L,10XPCR緩沖液 (該緩沖液購自武漢晶美生物工程有限公司)5 μ L，25mmol/L MgCl2 2. 5 μ L, 10 μ mol/L Pl 1 μ L, 10μ mol/L Ρ2 1 μ L, 2mmol/L dNTPs2 μ L, TaqE 1 μ L, Ckffl2O 32. 4 μ L0
擴(kuò)增條件為95°C變性5min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C lmin,57°C lmin, 72°C, Imin0 35個循環(huán)后，72°C延伸IOmin。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分 析，擴(kuò)增2個片段大小分別為863bp和900bp，與預(yù)期大小相當(dāng)。將得到的目的基因克隆到 PMD-18T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)，將重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有 限公司進(jìn)行外源基因序列的測定。
3. pRE Δ aroA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建
用KpnI和BamHI (購自寶生物工程(大連)有限公司)酶切大小為863bp的aroA上游同源臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，同時用相同的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pBluscriptSK(購自寶生 物工程(大連)有限公司)。將酶切的aroA上游同源臂和質(zhì)粒片段用T4DNA Iigase (購 自寶生物工程(大連)有限公司)連接(重組質(zhì)粒命名為pSKaroAl)，16°C水浴過夜，轉(zhuǎn)化 DH5a感受態(tài)細(xì)菌，37°C培養(yǎng)，挑菌，然后將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)獲得菌液用于小量 制備質(zhì)粒。用BamHI和SacI酶切大小為900bp的aroA下游同源臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，同時用相 同的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pSKaroAl。將酶切的下游同源臂和質(zhì)粒片段用T4DNA Iigase 連接(重組質(zhì)粒命名為？31(八虹0幻，161水浴過夜，轉(zhuǎn)化0!15 0感受態(tài)細(xì)菌，37°C培養(yǎng)，挑 菌，然后將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)獲得菌液用于小量制備質(zhì)粒。同時分別用KpnI和 SacI酶切載體pRE112和重組質(zhì)粒pSKAaroA?；厥彰盖羞^的上下游同源臂基因和載體 PRE112 (參見徐引弟，郭愛珍，陳煥春.豬霍亂沙門氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的構(gòu)建 及鑒定，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2008，16 (2) 196-201)，然后用T4DNA Iigase連接，16°C水浴 過夜，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，37°C培養(yǎng)，挑菌，然后將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)獲得菌 液用于小量制備質(zhì)粒和KpnI和SacI雙酶切鑒定。重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRE Δ aroA的物理圖譜見 圖1。鑒定結(jié)果證 實構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PRE AaroA是正確的(見圖2)，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRE Δ aroA 構(gòu)建流程如圖3所示。
4.本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株的構(gòu)建與鑒定
將本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRE Δ aroA轉(zhuǎn)化至供體菌大腸桿菌X7213 (該大腸桿菌 菌株購自寶生物工程(大連)有限公司)以轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒PRE AaroA的大腸桿菌X7213 為供體，支氣管敗血波氏桿菌HH0809為受體進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。供體菌和受體菌分別在適合的 瓊脂平皿上培養(yǎng)過夜，然后用TSB洗兩遍，調(diào)整菌濃度至0D600為0. 8。各取100 μ L菌懸液 混合，將無菌硝酸纖維濾膜貼于含2’6_ 二氨基庚二酸(DAP，購自Sigma公司)的TSA培養(yǎng) 基上，并于37°C預(yù)溫，然后將混合菌液滴于濾膜上，使之慢慢吸收。37°C接合4小時，同時 做供體和受體對照。然后用TSB洗下濾膜上的支氣管敗血波氏桿菌，重懸后再用TSB洗兩 遍，涂布在含氯霉素(Cm，購自Sigma公司)的TSA培養(yǎng)機(jī)上，37°C培養(yǎng)過夜24小時。Cm抗 性菌落進(jìn)一步用PCR鑒定。PCR反應(yīng)1(用引物C1/T2擴(kuò)增)用來確定發(fā)生了第一次交換， PCR反應(yīng)2(用引物Cml/Cm2擴(kuò)增)來確定pRE112中的Cm表達(dá)盒的存在，從而說明轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒已經(jīng)整合到支氣管敗血波氏桿菌的染色體上了。將有正確PCR擴(kuò)增條帶的接合子接種于 無NaCl的aromix改良LB固體培養(yǎng)基(為LB為基本培養(yǎng)基，附加二羥基苯甲酸(DHB)、對 氨基苯甲酸(PABA)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)，使終濃度均為40 μ g/ mL)培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)過夜后，搖渾的菌液再取5 μ L在無NaCl的aromix改良LB固 體培養(yǎng)基培養(yǎng)基中傳代，這樣進(jìn)行20次，每代稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)涂布aromix改良LB固體培 養(yǎng)基。40h培養(yǎng)后，挑取單菌落影印到Cm抗性aromix改良LB固體培養(yǎng)基上。篩選出Cm敏 感(Cm sensitive, Cms)的克隆，然后用反應(yīng)1和反應(yīng)2進(jìn)行PCR鑒定，以確定發(fā)生了第二 次交換(見圖4)。
PCR鑒定單交換質(zhì)粒整合到染色體上后，aroA的前后臂將有兩個拷貝，一個是缺 失型，一個是野生型，因此用上臂上游引物Cl和下臂下游引物T2可以擴(kuò)增出兩個片段，野 生型是3092bp，缺失型是1763bp (如圖5)。
PCR鑒定雙交換陽性接合子在無抗性無NaCl的aromix改良LB固體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過夜并傳代，篩選Cms菌落，用引物Cl與T2進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。發(fā)生第二次同源重組，可以產(chǎn)生兩種結(jié)果，一種是得到aroA缺失株，一種是回復(fù)野生型。正確的aroA缺失株用 Cl與T2只能擴(kuò)增出1763bp的片段(代表缺失型)(如圖6)，并用Cml和Cm2無法擴(kuò)增出 Cm基因盒。將Cl和T2擴(kuò)增得到的片段送上海生工測序，測序證明缺失菌株缺失了目的片 段-—aroA全基因。
5.支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株QH0814 Δ aroA生物學(xué)特性及鑒定
(1)支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株的遺傳穩(wěn)定性分析，將得到的基因缺 失株QH0814 Δ aroA在aromix改良LB固體培養(yǎng)基的平皿上傳10代，每代都用Cl與T2鑒 定遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果顯示連續(xù)傳10代，都只能擴(kuò)增出缺失型的1763bp的片段(如圖7所 示)，說明本發(fā)明制備的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失株QH0814 Δ aroA中的aroA的缺失是 很穩(wěn)定的。PCR操作的具體步驟是提取aroA基因缺失株QH0814 Δ aroA基因組DNA(方法 如前述)，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在50 μ L的體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系如下模 板基因組DNA 5 μ L, 10 X5 μ L, 10 μ mol/L Pl 2yL, 10ymol/L P2 2μ L,2mmol/ LdNTPs 8 μ L，TaqE 0. 5 μ L, ddH20 22. 5 μ L。擴(kuò)增條件為95°C變性 5min 后進(jìn)入循環(huán)，循 環(huán)參數(shù)為 94°C lmin,59°C lmin,72°C 4min 30sec。30 個循環(huán)后，72°C延伸 lOmin。結(jié)果如 圖7所示本發(fā)明制備的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株QH0814 Δ aroA能夠穩(wěn)定 遺傳。
(2)支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株QH0814 Δ aroA生長特性分析
Aromix改良LB固體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)36h，本發(fā)明制備的支氣管敗血波氏桿菌 aroA缺失株菌落比親本菌HH0809明顯小，其直徑約為1mm，較親本株(2mm)小1倍。親本 株(野生菌株)HH0809與本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA缺失株從107CFU/mL開始，在 aromix改良TSB (添加體積為10%的小牛血清)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2h取樣，平板法計 數(shù)并測0D600nm值，繪制生長曲線。結(jié)果顯示，aroA缺失株生長速度明顯慢于親本株菌株 (見圖8)，親本株6 22h左右左右進(jìn)入對數(shù)生長期，本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA 缺失株則需8 24h進(jìn)入對數(shù)生長期。
經(jīng)以上實驗證實，本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA缺失菌株QH0814 Δ aroA構(gòu) 建是成功的，于2007年1月19日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為 CCTCC NO :M208018。
6、支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失疫苗的制備
將本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株(實驗編號野生菌株為 HH0809,本發(fā)明的aroA基因缺失菌株為QH0814 Δ aroA)進(jìn)行鑒定，共進(jìn)行20代鑒定，每 代接種于aromix改良的LB培養(yǎng)基上，利用支氣管敗血波氏桿菌aroA基因及其上下游同 源臂進(jìn)行PCR檢測鑒定重組細(xì)菌的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)20次傳代后發(fā)現(xiàn)仍然只能擴(kuò)增出大小 為1700bp左右的片段，表明申請人構(gòu)建的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株具有遺 傳穩(wěn)定性。將該支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株先在aromix改良的LB固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，然后挑取單菌落于aromix改良的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到活細(xì)菌濃度達(dá)到 2X1010CFU/mL,將所述的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株的菌液與明膠保護(hù)劑按 體積比為7 1(該明膠保護(hù)劑的配制方法是每IOOmL去離子水中加蔗糖40g，明膠8g，充 分融化后，置121°C下滅菌30min后保存?zhèn)溆?，于滅菌凍干瓶中按2. OmL/瓶分裝，置_50°C 冷凍干燥機(jī)中凍干，凍干36-40h后壓蓋，復(fù)蘇后確定沒有雜菌污染，置_20°C保存?zhèn)溆?，即為本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失疫苗。
7、支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失株對小鼠的LD5tl測定
將支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株QH0814 Δ aroA與對照親本株HH0809 在aromix改良LB固體培養(yǎng)基中傳代活化，挑取單菌落在aromix改良LB液體培養(yǎng)基中 37°C培養(yǎng)16h，通過平板法計數(shù)。然后用5倍比稀釋，每個稀釋度腹腔注射(i.p)4只5周齡 Balb/C雌鼠，每只500yL，觀察14天，統(tǒng)計出90%以上死亡和10 %以下死亡的劑量，分別 作為正式試驗的最高與最低劑量。將預(yù)試驗得出的最高、最低劑量換算為常用對數(shù)，然后將 最高、最低劑量的對數(shù)差，分為4個對數(shù)等距的劑量組，每組6只Balb/C小鼠，開始正式試 驗。每個稀釋度腹腔注射6只5周齡Balb/C雌鼠，每只500 μ L觀察14天，死亡小鼠肺臟 無菌接種aromix改良LB固體培養(yǎng)基，用引物F1/F2和C1/T2擴(kuò)增鑒定，統(tǒng)計出每組死亡情 況。根據(jù)寇氏(Korbor)法計算LD50，計算的公式為
logLD50 = Xm-d( Σ Ρ_0· 5)
在上面的公式中Xm為最大劑量對數(shù)，d為相鄰劑量比值對數(shù)，ρ為各組的死亡率 (死亡率以小數(shù)表示)，Σ P為各組死亡率的組合。
將過夜培養(yǎng)的親本菌株(ΗΗ0809)和本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失 菌株分別按體積比1 1000比例接種到20mL改良TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至0D600約0. 8，連續(xù) 2倍稀釋，每個稀釋度腹腔注射(i. P) 8只Balb/c小鼠，每只200 μ L，連續(xù)觀察5天，記錄小 鼠死亡情況。
結(jié)果見表1 從小鼠存活情況看，本發(fā)明的QH0814AaroA的毒力有所降低，表明本 發(fā)明的aroA基因缺失菌株QH0814 Δ aroA毒力明顯降低。
表1本發(fā)明的aroA基因缺失疫苗菌株QH0814 Δ aroA與親本株毒力比較試驗
/
菌株細(xì)菌劑量(CFU)死亡數(shù)/總數(shù)0LD50 (CFU)
1.08x10s0/6
今山曲2.6x1070/6,
HH0809(親本菌)2. Ix IO6
6.5xl061/6
1.6xl066/6
1.24x10s0/6
A ,3.1xl070/66
QH08 HAara^7.74><106
7.8xl066/6
1.95χ1066/6
PBS 對照ImL0/6
8.支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失疫苗免疫仔豬的保護(hù)性試驗
1)豬的免疫程序[0069]選擇豬支氣管敗血波氏桿菌抗原，抗體陰性的7日齡的哺乳仔豬14頭，試驗分4 組，第1組為基因缺失疫苗組，編號1 5，第二組為支氣管敗血波氏桿菌滅活疫苗組，編 號6 10，第三組為無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，各組分濃度137mM NaCl, 2. 7mM KCl，10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4 pH = 7. 2)對照組，編號11 13，第5組為空白對照，編號14 15。
磷酸緩沖液PBS對照組每頭豬滴鼻ImL PBS，本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA 基因缺失疫苗免疫組通過滴鼻免弱毒疫苗ImL (活菌含量1. OX IO9CFU)，滅活疫苗免疫組通 過肌肉注射2mL滅活疫苗(滅活支氣管敗血波氏桿菌含量1. 3X IO9CFU)，免疫2次，間隔3 周。在一免后3周和二免后3周各采血一次，用常規(guī)的ELISA方法檢測針對支氣管敗血波 氏桿菌全菌的抗體水平。
表4本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失疫苗免疫仔豬試驗動物分組設(shè) 計
權(quán)利要求
一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株，其特征是該菌株是支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)QH0814ΔaroA，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NOM208018，該菌株的缺失了5 烯醇丙酮酰莽草酸 3 磷酸合成酶(aroA)基因全長1340bp，導(dǎo)致該菌株對芳香族氨基酸的代謝出現(xiàn)障礙。
2.一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗，其特征在于，該疫苗是權(quán)利要求
1所述的 菌株制備的。
3.權(quán)利要求
1所述的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株在制備支氣管敗血波氏桿菌 基因缺失疫苗的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，所述的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗是支氣管敗血波 氏桿菌基因缺失弱毒活疫苗。
專利摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種支氣管敗血波氏桿菌aroA(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)基因缺失菌株的構(gòu)建，基因缺失疫苗的制備與應(yīng)用。所述支氣管敗血波氏桿菌支氣管敗血波氏桿基因缺失菌株(Bordetellabronchiseptica)QH0814ΔaroA，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCNOM208018，該菌株的缺失了5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(aroA)基因全長1340bp，導(dǎo)致該菌株對芳香族氨基酸的代謝出現(xiàn)障礙。本發(fā)明利用該基因缺失菌株制備了支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗。本發(fā)明還公開了所述基因缺失菌株在制備支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗(弱毒活疫苗)的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/10GKCN101575586 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910062245
公開日2011年1月19日 申請日期2009年5月31日
發(fā)明者何華, 何啟蓋, 盧順, 吳斌, 李倫勇, 湯細(xì)彪, 胡睿銘, 金梅林, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),