專利名稱:一種哈茨木霉菌株的制作方法
一種哈茨木霉菌株技術領域：
[0001]本發(fā)明涉及一種菌株，尤其涉及一種具有對多種土傳病害有高拮抗的哈茨木霉菌株。
背景技術：
[0002]在當代瓜果蔬菜等植物大規(guī)模生產(chǎn)的模式下，由真菌引致的病害已經(jīng)成了影響植物質量，產(chǎn)量以及保存的主要問題。這些該病原菌是寄主廣泛的兼性寄生真菌，他們侵染原十分廣泛，它可寄生多種水果、蔬菜與花卉，不僅在植物生長過程中不僅可侵染果梗、新梢與幼嫩葉片，危害花序、幼果和將要成熟的果實，而且還常常因該病菌的潛伏存在，成為儲藏、運輸、銷售期間引起果實腐爛的主要病害。如灰霉病，其是由半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、葡萄孢屬Botrytis cinerea pers. ex Fr.侵染引起的,可嚴重危害植物的生長,保存， 尤其是對于葡萄培養(yǎng)。還如枯萎病(blight亦稱疫病)，其由真菌或細菌引致的植物病害， 發(fā)病突然，癥狀包括嚴重的點斑、凋萎或葉、花、果、莖或整株植物的死亡。生長迅速的幼嫩組織常被侵襲。大多數(shù)重要經(jīng)濟作物均受一種或多種疫病感染。疫病可影響花、葉、芽包、 幼苗、小枝、莖(藤)及頂梢。[0003]目前，主要通過定期向農作物噴灑農藥的從而抑制植物病害。如安萬特作物科學公司生產(chǎn)的普力克殺菌劑，豈可有效通過抑制病菌細胞膜成分的磷脂和脂肪酸的生物合成，抑制菌絲生長、孢子囊的形成和萌發(fā)。從而達到防治植物病害的目的。又如公告號 CN13000082C的中國專利提供了一種間苯三酚乙?；苌飶亩行Х乐蚊藁⒖莶?、小麥紋枯病、黃萎病等植物病害，還如公開號為CN101305729A的中國專利申請文件提供了一種由代森聯(lián)和戊唑醇組成的一種防止蘋果斑點落葉病、輪紋病復配殺菌組合物；又如公開號為CN101731245A的中國專利申請文件公開了一種以嘧菌環(huán)胺與代森聯(lián)按特定比例的配置的組合物以抑制葡萄灰霉病、蘋果斑點落葉病、素材灰霉病等。[0004]然而在使用中，由于農藥一般采用較大的毒性以殺滅真菌的方式預防葡萄灰霉病，其制備工藝較為復雜，危險性強。而且對于農產(chǎn)品有一定的危害性，同時也會對于環(huán)境造成嚴重污染。[0005]因而人們常識對于微生物菌種利用，直接抑制引起植物病害的真菌，如公開號為 CN101870959A的中國專利申請文件公開了一種枯草芽孢桿菌，其對于梨輪紋病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等有顯著的防治效果。[0006]還如在研究中發(fā)現(xiàn)，木霉菌也具有拮抗微生物病菌的功效，其對于土傳植物病原真菌具有強大的抑制效果，但在時間培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)木霉菌產(chǎn)孢量小、其穩(wěn)定性較差，對于外部環(huán)境的適應性較差，因而難以工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
發(fā)明內容
[0007]本發(fā)明提供一 種哈茨木霉菌株的篩選方法、以及所述方法篩選得到的哈茨木霉菌株，本發(fā)明哈茨木霉菌株的產(chǎn)孢量大，以易于培愈，具有高效防治由真菌引發(fā)的植物病害作用。[0008]本發(fā)明第一個目的是提供一種哈茨木霉菌株的篩選方法，具體方法如下稱取含哈茨木霉菌的土壤樣品于水中，在渦旋儀上混勻后進行梯度稀釋至10_5，加入到木霉菌選擇性培養(yǎng)基表面，均勻涂布，該培養(yǎng)基在25°c靜置培養(yǎng)，根據(jù)平皿上篩選到的真菌菌落的形態(tài)、顏色、大小挑選出木霉菌菌落并轉移至PDA培養(yǎng)基，進行純化、培養(yǎng)。[0009]所述木霉菌選擇性培養(yǎng)基配方包括翁304*7!120、腿2 04、1((1、順4勵3、葡萄糖、氯霉素、甲基磺、五氯硝基苯、玫瑰紅、瓊脂。[0010]最為優(yōu)選地，本發(fā)明木霉菌選擇性培養(yǎng)基配方包括=MgSO4 · 7H20 O. 2g/L、KH2PO4O.9g/L、KCl O. 15g/L、NH4N031. Og/L、葡萄糖 3g/L、氯霉素 0. 25g/L、甲基磺 0. 3g/L、五氯硝基苯0. 2g/L、玫瑰紅0. 15g/L、20g瓊脂。[0011]本發(fā)明上述方法篩選的第一種哈茨木霉菌株{Trichodema harizianuni)子中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 5202。[0012]上述的哈茨木霉菌株的防治由真菌引起的植物病害中的應用。[0013]上述的哈茨木霉菌株的應用，其中，所述由真菌或細菌引起的植物病害為枯萎病。[0014]采用本發(fā)明一種哈茨木霉菌株的優(yōu)點在于本發(fā)明一種哈茨木霉菌株可通過自身產(chǎn)生的真菌細胞壁降解酶如幾丁質酶、葡聚糖酶等溶解病原菌細胞壁并滲透進入其細胞中，使病原真菌生長受抑制而死亡而實現(xiàn)病害的防治作用，高效防治由真菌引發(fā)的植物病害；而且本發(fā)明哈茨木霉菌株易于培育，產(chǎn)孢量大適合工業(yè)大批量生產(chǎn)，使用范圍廣，實用性強。


[0015]圖1為本發(fā)明哈茨木·霉菌株在PDA培養(yǎng)基上25°C黑暗7d的菌落形態(tài)；圖2為本發(fā)明哈茨木霉菌株的分生孢子梗，瓶梗形態(tài)；圖3為本發(fā)明哈茨木霉菌株的分生孢子形態(tài)。
具體實施方式
[0016]本發(fā)明哈茨木霉菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCC NO. 5202。其分生孢子階段為半知菌門，絲孢綱；有性態(tài)是屬于子囊菌門子囊菌綱。[0017]本發(fā)明哈慈木霉菌株篩選方法稱取Ig 土樣于IOml水中，在渦旋儀上混勻后進行梯度稀釋至10_5，取Iml加入到木霉菌選擇性培養(yǎng)基TSM表面，均勻涂布，該培養(yǎng)基在25°C靜置培養(yǎng)5 7天，根據(jù)平皿上篩選到的真菌菌落的形態(tài)、顏色、大小挑選出木霉菌菌落并轉移至PDA培養(yǎng)基，進行純化、培養(yǎng)及進一步鑒定。[0018]TSM 培養(yǎng)基配方MgS04 · 7H20 O. 2g/L、KH2PO4 O. 9g/L、KCl 0. 15g/L、NH4NO31. Og/ L、葡萄糖3g/L、氯霉素0. 25g/L、甲基磺0. 3g/L、五氯硝基苯0. 2g/L、玫瑰紅0. 15g/L、20g瓊脂。[0019]本發(fā)明的哈茨木霉菌株的顯微形態(tài)特性如圖1和2所示，本發(fā)明哈茨木霉菌株在PDA培養(yǎng)基25°C，黑暗7天條件下培養(yǎng)時，很明顯地可以觀察到其分生孢子梗復雜分枝，初級分枝幾乎呈直角，常2 3個旋渦狀排列，向基部逐漸變長整個結構類似金字塔形狀。本發(fā)明哈茨木霉菌株的瓶梗為安瓿形至亞球星或壇形，經(jīng)測試，其長度達3. 5^7. 5 X 2. 5^3. 8 μ m,而頂生瓶?？砷L達10 μ m,且其基部明顯縊縮，中部顯著膨大.如圖3所示，本發(fā)明哈茨木霉菌株的分生孢子亞球形至卵圓形或短的橢球形，多數(shù)為長度達1. 7^3. 2X1. 3 2. 5 μ m，而且經(jīng)觀察，其壁光滑很少粗糙半透明至淺綠色。[0020]本發(fā)明的哈茨木霉菌株的系統(tǒng)發(fā)育學鑒定通過引物ITS4和ITS5擴增ITS1-5. 8S-1TS2區(qū)序列，得到1186bp的序列段，通過NCBI GenBank進行比對，與哈茨木霉達到100%的相似度。[0021 ] 1186bp 的 ITS 序列如下TTGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAG GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCC GGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTT TTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCT TGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCC GGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCT CTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATG TTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGG提供采用引物Ef728和Tefl a R擴增Tefl a序列，到1090bp的序列段，通過NCBI GenBank進行比對，與哈茨木霉達到100%的相似度。[0022]1164bp 的 Tefl a 序列如下CATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAACCTTCAACTGATTTTCGCCTCG ATTCTTCCTCTCTTCACATTCAATTGTGCCCGACAATTCTGCAGAGAATTTTCGTGTCGACAATTTTTCATCACCCC GCTTTCCATTACCCCTCCTTTCCAGCGACGCAAATTTTTTTTTCTGTCGTTTGGTTTTTAGTGGGGTTCTCTGTGCA ACCCCACTAGCTCCCTGCTTTTTCCTGCTTCACTCTCACTTCCTCGTCATCATTCAACGTGCTCTGCGTCTTTGGTC ATTCAGCGACGCTAACCACTTTTCCATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCTTGGGT TCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATTGACATTGCTCTGTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGT ACTATGTCACCGTCATTGGTAAGTCTTCACTAAGTTCATGCTGCAATTGCGGACCAGTGCTAACAGGCAATTCACAG ACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCCAGGCCGATTGCGCTATCCTCATCATT GCCGCCGGTACTGGTG AGTTCGAGGCTGGTATCTC CCAAGGATGGC培育方法本發(fā)明的哈茨木霉菌株的培養(yǎng)條件為在PDA培養(yǎng)基上，于25°C下菌絲生長最快(形態(tài)如圖1所示)。在PDB培養(yǎng)基內，于30°C下分生孢子的產(chǎn)量最大。在30°C下，由于分生孢子豐富，產(chǎn)孢簇表面常呈顆粒狀或粉狀；平展產(chǎn)孢區(qū)常呈黃綠色，反面無色至暗黃色。[0023]本發(fā)明的哈茨木霉菌株，其液體培養(yǎng)法為，每250mL三角瓶中加IOOmL的PDB培養(yǎng)液，每瓶接種孢子懸浮液lmL，在30°C，150r/min下振蕩培養(yǎng)，第5天便可收獲大量的孢子。 添加體積比為1:1的硅藻土，抽濾干燥備用。[0024]本發(fā)明哈茨木霉菌株的產(chǎn)孢量大，而且培育過程中，條件易控制，便于培育。[0025]注PDA培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的簡稱，即Potato Dextrose Agar (Medium);配方其包括葡萄糖20g,瓊脂18g,水(馬鈴薯煮的汁,過濾)1000ml。[0026]在PDB是液體培養(yǎng)基，在PDA的基礎上不加瓊脂即可，配方如PDA培養(yǎng)基。[0027]防治植物病害作用效果本發(fā)明哈茨木霉菌株通過重寄生性，即通過自身產(chǎn)生的真菌細胞壁降解酶如幾丁質酶、葡聚糖酶等溶解病原菌細胞壁并滲透進入其細胞中，使病原真菌生長受抑制、死亡而實現(xiàn)的。因此幾丁質酶活是衡量菌株的拮抗能力的重要指標。該菌株的幾丁質酶活OD值為O.138。因而本發(fā)明哈茨木霉菌株對于真菌細胞具有良好的拮抗能力。[0028]下面我們通過具體實驗說明本發(fā)明哈茨木霉菌株對于防治植物病害的作用 實施例1 :對辣椒枯萎病的大田防治用哈茨木霉CGMCC No. 5202制劑對辣椒枯萎病進行防治試驗方法實驗期間共施藥3次，第一次定植(2010年04月25日)；第二次開花期(2010年05 月11日);第三次初果期(2010年05月27日)。2010年04月25日定植，當天進行灌根處理，每個灌根500mL的哈茨木霉制劑。[0029]實驗條件描述在田間規(guī)格、品種及肥水管理等條件一致。且每次施藥后當天均無降雨發(fā)生，試驗期間未進行任何施肥、灌溉和其他病蟲害的防治。[0030]數(shù)據(jù)測試方法病害嚴重度分級調查。每小區(qū)采用隨機取樣，每點調查20 40株。每小區(qū)隨機調查五個點，每點查5株，記錄病株數(shù)、死株數(shù)或明顯枯萎的植株數(shù)。分級方法(按癥狀類型分級)0級健康無癥；1級地上部僅葉、果有病斑；3級地上莖、枝有褐腐斑；5級有褐腐斑 ；7級地上莖、枝與莖基部均有褐腐斑，并且部分枝條枯死；9級全株枯死。調查時間和次數(shù)，施藥前調查病情基數(shù)。采用隨機調查法，計算病情指數(shù)和防效，用鄧肯氏新復極差法測定差異顯著性。調查發(fā)病病級在最后一次施藥后第3天，調查產(chǎn)量，進行對比。[0031]其中，實施例采用本發(fā)明哈茨木霉菌株；對比例1:普力克殺菌劑；對比例2 :代森錳鋅藥劑；對比例3，空白對照不采用任何防治措施。[0032]具體結果對比見表I。[0033]數(shù)據(jù)分析由表I可以看出，空白對照處理與全部藥物處理之間存在顯著性差異；這說明所有的藥物處理相對空白對照對辣椒枯萎病的防治都有一定防治效果。而且哈茨木霉菌株制劑相對其他對比組，其具有明顯的優(yōu)異效果。[0034]表1，各處理方法對辣椒枯萎病防治效果對比
權利要求
1.一種如權利要求
1所述方法篩選的哈茨木霉菌株Aarizia/w ),其特征在于，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNO. 5202。
2.一種如權利要求
1所述的哈茨木霉菌株的在防治由真菌或細菌引起的植物病害中的應用。
3.根據(jù)權利要求
2所述的應用，其特征在于，所述由真菌或細菌引起的植物病害為枯萎病。
專利摘要
本發(fā)明一種哈茨木霉菌株(Trichodermaharzianum)，其中，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.5202。本發(fā)明一種哈茨木霉菌株可通過自身產(chǎn)生的真菌細胞壁降解酶溶解病原菌細胞壁并滲透進入其細胞中，使病原真菌生長受抑制而死亡而實現(xiàn)病害的防治作用，高效防治由真菌引發(fā)的植物病害；而且本發(fā)明哈茨木霉菌株產(chǎn)孢量大，易于培育，適合工業(yè)大批量生產(chǎn)，使用范圍廣，實用性強。
文檔編號C12R1/885GKCN103045482SQ201110305997
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日
發(fā)明者曠文豐, 王承芳, 張鈺, 王軍, 胡曲瑞, 毛偉力 申請人:上海萬力華生物科技有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan