本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)，更具體地說(shuō)，它涉及一種檢測(cè)甲乙型流感及呼吸道合胞三種病毒的試劑盒以及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、甲型流感病毒與乙型流感病屬于正粘病毒科單鏈負(fù)向rna病毒，兩者在病毒結(jié)構(gòu)、基因組和流行病學(xué)上具有很高的相似性，可通過(guò)基質(zhì)蛋白(m蛋白)和核蛋白(np蛋白)的不同來(lái)區(qū)分；呼吸道合胞病毒屬于副黏病毒科的肺病毒屬，病毒形態(tài)為球形，直徑為120~300nm，有包膜，基因組為非分節(jié)段的單負(fù)鏈rna，主要編碼10種蛋白質(zhì)，即融合蛋白（f）、黏附蛋白（g）和小疏水蛋白（sh）三種跨膜蛋白，兩種基質(zhì)蛋白m1和m2，三種與病毒rna相結(jié)合形成核衣殼的蛋白（n、p和l），兩種非結(jié)構(gòu)蛋白（ns1和ns2），病毒包膜上有糖蛋白組成的刺突，無(wú)ha、na和hl。

2、目前用于甲型流感、乙型流感，呼吸道合胞病毒檢測(cè)方法有抗原檢測(cè)法、免疫層析法、核酸檢測(cè)法等。其中抗原檢測(cè)法雖然檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)短，成本低，但結(jié)果判讀錯(cuò)誤率高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；免疫層析法對(duì)操作方式、取樣位置、患病階段等要求較高，檢測(cè)出來(lái)的準(zhǔn)確性和靈敏度也存在不確定性；核酸檢測(cè)法因其高效特異、使用靈活、操作相對(duì)簡(jiǎn)單且成本低的優(yōu)勢(shì)，成為當(dāng)前呼吸道病原體核酸檢測(cè)最普遍的核酸診斷方法。

3、目前市場(chǎng)上采用最多的方法大多是在鼻拭子、咽拭子、口腔拭子的基礎(chǔ)上提取、純化出核酸物質(zhì)，再進(jìn)行檢測(cè)?；诤怂崽崛〉膒cr方法實(shí)驗(yàn)步驟較多，流程較長(zhǎng)，檢測(cè)過(guò)程中易出現(xiàn)污染；因此，本領(lǐng)域需要一種檢測(cè)型別全面，操作方便快速的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)方法，從而節(jié)約時(shí)間和成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)甲乙型流感及呼吸道合胞三種病毒的試劑盒，省卻了核酸提取步驟，操作方便快速，且檢測(cè)型別全面，適用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。

2、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種檢測(cè)甲乙型流感及呼吸道合胞三種病毒的試劑盒，

3、包括用于檢測(cè)三種病毒基因的引物和探針組合：

4、核苷酸序列如seq?id?no.1所示的甲型流感病毒上游引物1；

5、核苷酸序列如seq?id?no.2所示的甲型流感病毒上游引物2；

6、核苷酸序列如seq?id?no.3所示的甲型流感病毒下游引物；

7、核苷酸序列如seq?id?no.4所示的甲型流感病毒探針，所述甲型流感病毒探針序列5'端標(biāo)記有fam熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb淬滅熒光基團(tuán)；

8、核苷酸序列如seq?id?no.5所示的乙型流感病毒上游引物；

9、核苷酸序列如seq?id?no.6所示的乙型流感病毒下游引物1；

10、核苷酸序列如seq?id?no.7所示的乙型流感病毒下游引物2；

11、核苷酸序列如seq?id?no.8所示的乙型流感病毒探針，所述乙型流感病毒探針序列5'端標(biāo)記有vic熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb?sq淬滅熒光基團(tuán)；

12、核苷酸序列如seq?id?no.9所示的呼吸道合胞病毒上游引物1；

13、核苷酸序列如seq?id?no.10所示的呼吸道合胞病毒上游引物2；

14、核苷酸序列如seq?id?no.11所示的呼吸道合胞病毒上游引物3；

15、核苷酸序列如seq?id?no.12所示的呼吸道合胞病毒下游引物1；

16、核苷酸序列如seq?id?no.13所示的呼吸道合胞病毒下游引物2；

17、核苷酸序列如seq?id?no.14所示的呼吸道合胞病毒探針1，所述呼吸道合胞病毒探針1序列5'端標(biāo)記有cy5熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb淬滅熒光基團(tuán)；

18、核苷酸序列如seq?id?no.15所示的呼吸道合胞病毒探針2，所述呼吸道合胞病毒探針2序列5'端標(biāo)記有cy5熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb淬滅熒光基團(tuán)。

19、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，所運(yùn)用的引物和探針組合，能夠采用的拭子直擴(kuò)結(jié)合熒光pcr法，完成甲型流感病毒、乙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒三種病毒的快速檢測(cè)，省卻了核酸提取步驟，操作方便快速，且檢測(cè)型別全面，適用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)；同時(shí)，針對(duì)甲型流感病毒采用雙上游引物，針對(duì)乙型流感病毒采用雙下游引物，針對(duì)呼吸道合胞病毒采用三上游引物和雙下游引物雙探針設(shè)計(jì)，針對(duì)編碼單個(gè)氨基酸的所有不同堿基可能性進(jìn)行設(shè)計(jì)，允許擴(kuò)增所有編碼已知順序的核酸序列，提高檢測(cè)的廣譜性，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)三種病毒的技術(shù)要求，并通過(guò)選擇簡(jiǎn)并性小的氨基酸和避免引物3’末端簡(jiǎn)并，可以提高pcr產(chǎn)物的特異性，有針對(duì)性的引物富集目標(biāo)序列，避免了對(duì)整個(gè)基因組的測(cè)序，降低了測(cè)序成本，提高了檢測(cè)效率。

20、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：還包括內(nèi)參基因的引物探針組合，所述內(nèi)參引物探針組合包括：

21、核苷酸序列如seq?id?no.16所示的β-globin上游引物；

22、核苷酸序列如seq?id?no.17所示的β-globin下游引物；

23、核苷酸序列如seq?id?no.18所示的β-globin探針，所述β-globin探針序列5'端標(biāo)記有rox熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb淬滅熒光基團(tuán)。

24、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：還包括擴(kuò)增酶，所述擴(kuò)增酶用于擴(kuò)增鼻腔拭子樣本的內(nèi)核酸，并參與熒光pcr反應(yīng)程序。

25、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：擴(kuò)增所述甲型流感病毒上游引物1和甲型流感病毒上游引物2的終濃度均為0.1μmol/l，擴(kuò)增所述甲型流感病毒下游引物的終濃度為0.2μmol/l，檢測(cè)所述甲型流感病毒探針的終濃度為0.1μmol/l。

26、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：擴(kuò)增所述乙型流感病毒上游引物的終濃度為0.2μmol/l，擴(kuò)增所述乙型流感病毒下游引物1和乙型流感病毒下游引物2的終濃度均為0.1μmol/l，檢測(cè)所述乙型流感病毒探針的終濃度為0.1μmol/l。

27、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：擴(kuò)增所述呼吸道合胞病毒上游引物1的終濃度為0.2μmol/l，擴(kuò)增所述呼吸道合胞病毒上游引物2和呼吸道合胞病毒上游引物3的終濃度均為0.1μmol/l，擴(kuò)增所述呼吸道合胞病毒下游引物1和呼吸道合胞病毒下游引物2的終濃度均為0.2μmol/l，檢測(cè)所述呼吸道合胞病毒探針1和呼吸道合胞病毒探針2的終濃度均為0.1μmol/l。

28、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：擴(kuò)增所述β-globin上游引物和β-globin下游引物的終濃度均為0.1μmol/l，檢測(cè)所述β-globin探針的終濃度為0.05μmol/l。

29、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：還包括陽(yáng)性對(duì)照品a1管和陰性對(duì)照品b1管；所述陽(yáng)性對(duì)照品a1管為含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒以及內(nèi)標(biāo)序列的假病毒對(duì)照；所述陰性對(duì)照品b1管為含內(nèi)標(biāo)序列的假病毒。

30、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：通過(guò)凍干程序經(jīng)原位凍干將試劑盒內(nèi)的三組液體分別制成凍干粉末，三份所述凍干粉末分別為試劑凍干粉末、陽(yáng)性對(duì)照品粉末以及陰性對(duì)照品粉末。

31、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種試劑盒的使用方法，有效提高了混合的均勻性，保證了基層使用時(shí)擴(kuò)增模板和檢測(cè)試劑的濃度比，進(jìn)一步提高現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)的便捷性。

32、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

33、s1.獲取待測(cè)鼻腔拭子樣本，置于無(wú)酶水內(nèi)，使得鼻腔粘膜細(xì)胞釋放核酸，制成拭子液作為擴(kuò)增模板；

34、s2.將配置好的檢測(cè)三種病毒基因的引物和探針組合、內(nèi)參基因的引物探針組合以及擴(kuò)增酶充分混合，將該混合液體試劑通過(guò)凍干程序經(jīng)原位凍干制成試劑凍干粉末；

35、s4.將s1制得的擴(kuò)增模板，取25μl直接投入到s2所配置的試劑凍干粉末中進(jìn)行溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增程序，通過(guò)ct值進(jìn)行結(jié)果判斷。

36、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，通過(guò)凍干程序?qū)z測(cè)試劑進(jìn)行凍干處理，從而可以采用液體的擴(kuò)增模板溶解粉末狀的試劑凍干粉末的方式實(shí)現(xiàn)兩者的充分混合，相較于傳統(tǒng)的液態(tài)模板混合液態(tài)試劑，有效提高了混合的均勻性，保證了基層使用時(shí)擴(kuò)增模板和檢測(cè)試劑的濃度比，進(jìn)一步提高現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)的便捷性。

37、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：所述擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃逆轉(zhuǎn)錄5分鐘，1次循環(huán)；95℃預(yù)變性30秒，1次循環(huán)；95℃變性3秒，60℃退火15秒，交替45次循環(huán)。

38、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種試劑盒的使用方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)試劑自身質(zhì)量的檢測(cè)，以及對(duì)試劑是否遭受污染進(jìn)行了檢測(cè)，從而確保試劑的實(shí)際檢測(cè)效力。

39、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

40、s1.獲取待測(cè)鼻腔拭子樣本，置于無(wú)酶水內(nèi)，使得鼻腔粘膜細(xì)胞釋放核酸，制成拭子液作為擴(kuò)增模板；

41、s3.用25μl無(wú)酶水對(duì)陽(yáng)性對(duì)照品粉末進(jìn)行溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到一份試劑凍干粉末中進(jìn)行溶解混合，轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增程序；用25μl無(wú)酶水對(duì)陰性對(duì)照品粉末進(jìn)行溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到一份試劑凍干粉末中進(jìn)行溶解混合，轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增程序；通過(guò)ct值判斷質(zhì)控結(jié)果；

42、s4.將s1制得的擴(kuò)增模板，取25μl直接投入到一份試劑凍干粉末中進(jìn)行溶解混合，并將溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增程序，通過(guò)ct值進(jìn)行結(jié)果判斷。

43、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，通過(guò)步驟s3實(shí)現(xiàn)了對(duì)試劑自身質(zhì)量的檢測(cè)，以及對(duì)試劑是否遭受污染進(jìn)行了檢測(cè)，從而確保試劑的實(shí)際檢測(cè)效力。

44、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：針對(duì)編碼單個(gè)氨基酸的所有不同堿基可能性進(jìn)行設(shè)計(jì)，允許擴(kuò)增所有編碼已知順序的核酸序列，提高檢測(cè)的廣譜性，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)三種病毒的技術(shù)要求，并通過(guò)選擇簡(jiǎn)并性小的氨基酸和避免引物3’末端簡(jiǎn)并，可以提高pcr產(chǎn)物的特異性，有針對(duì)性的引物富集目標(biāo)序列，避免了對(duì)整個(gè)基因組的測(cè)序，降低了測(cè)序成本，提高了檢測(cè)效率；從樣本采集到出具結(jié)果最短僅需30分鐘，相較于傳統(tǒng)的熒光pcr法（約3小時(shí)），sanger測(cè)序法（約9小時(shí)），可以節(jié)約大量時(shí)間；省略了核酸提取的步驟，在節(jié)省時(shí)間的同時(shí)也降低了相應(yīng)的成本。同時(shí)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速準(zhǔn)確，節(jié)省大量人力成本。