本發(fā)明涉及一種鑒別蜂群王漿高產(chǎn)性狀的方法，具體涉及一種鑒別西方蜜蜂蜂群王漿高產(chǎn)性狀的插入缺失標記nc_037647.1_8674876及其應(yīng)用，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、蜂王漿是我國蜜蜂產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中主要的產(chǎn)品之一，不僅是調(diào)控蜜蜂發(fā)育和級型分化的關(guān)鍵因子，也對人類的身體健康有著非凡的保健價值。蜂王漿在調(diào)節(jié)血糖、抗阿爾茲海默癥等方面存在重要的藥理作用；蜂王漿具有抗菌作用，其主要活性物質(zhì)10-hda對金色葡萄球菌、大腸桿菌等有抑制效果；10-hda也有抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。因此，在改善人類健康、醫(yī)藥、保健品和化妝品方面廣泛應(yīng)用。

2、我國是蜂王漿生產(chǎn)大國，蜂王漿的產(chǎn)量占世界總量的90％以上，年生產(chǎn)量約4000t，這與我國飼養(yǎng)的蜜蜂品種有著密不可分的關(guān)系。1910年引入意大利蜜蜂，其蜂王漿產(chǎn)量每群每年大約是0.5～1kg，蜂王漿產(chǎn)量極低，供不應(yīng)求。在上世紀，我國無數(shù)科學(xué)家和養(yǎng)蜂工作者對該蜂種展開了選育研究試驗，收集了杭州、平湖、嘉興、桐廬、紹興和龍游等地區(qū)蜂王漿高產(chǎn)蜂群作為育種對象，經(jīng)過多年的定向選育和集團閉鎖繁育，運用太湖島嶼隔離和蜜蜂人工授精技術(shù)，培育出了生產(chǎn)性能卓越、遺傳性狀穩(wěn)定的意蜂新品系——“浙農(nóng)大1號”意蜂，其蜂王漿產(chǎn)量每群每年超過10kg，具有繁殖快、采集蜂蜜能力強、抗病力強、蜂王漿產(chǎn)量高、育蟲力強以及性情溫順等優(yōu)勢，之后還培育出了平湖漿蜂、蕭山漿蜂等蜂王漿高產(chǎn)蜂種。因此，蜂王漿高產(chǎn)蜂種的培育受到了越來越多的關(guān)注，帶來了極大的經(jīng)濟效益。

3、一直以來，我國的蜂業(yè)科技工作者致力于王漿高產(chǎn)蜜蜂的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)蜂王漿高產(chǎn)機制以及很多與蜂王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的遺傳標記，加強蜂王漿高產(chǎn)蜂種的保種和選育工作，充分發(fā)揮我國優(yōu)良蜂種資源的優(yōu)勢。就蜂王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)分子遺傳標記的研究及indel技術(shù)進行的研究概述如下：

4、1、蜂王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)分子遺傳標記的研究

5、在蜜蜂飼養(yǎng)中，蜂群的蜂王漿高產(chǎn)性能一直是養(yǎng)蜂者關(guān)注的重要因素。為了更加精準高效的判斷蜂群是否為蜂王漿高產(chǎn)蜂群，科學(xué)家們通過對分子遺傳標記技術(shù)進行深入研究，以尋找與蜂王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標記，從而為蜜蜂育種和選種提供科學(xué)依據(jù)。

6、分子遺傳標記是現(xiàn)代生物技術(shù)中的重要手段之一，它通過分析生物體基因組中的特定序列或基因多態(tài)性，來探究這些標記與目標性狀之間的關(guān)系。在蜜蜂王漿高產(chǎn)性狀的研究中，研究者們已經(jīng)廣泛應(yīng)用了幾種分子遺傳標記技術(shù)，包括隨機擴增多態(tài)dna-pcr(rapd-pcr)分析、微衛(wèi)星dna分析以及基因芯片技術(shù)。

7、針對不同品系的高產(chǎn)蜂種如“浙農(nóng)大1號”、平湖漿蜂和蕭山漿蜂，研究者們發(fā)現(xiàn)了特異的dna序列片段w316bp，這些片段在工蜂中普遍存在，而在雄蜂中則不存在，表明該片段可能與王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)聯(lián)，通過實驗驗證w316bp被確認為一個可靠的王漿高產(chǎn)性狀分子標記。微衛(wèi)星dna分析提供了另一種重要的分子標記方法；通過分析不同蜜蜂品種的微衛(wèi)星位點，發(fā)現(xiàn)了與王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的特定微衛(wèi)星標記。其中“浙農(nóng)大1號”蜜蜂的微衛(wèi)星標記顯示出其在進化歷史上的特殊性，并且與其高產(chǎn)性狀密切相關(guān)；隨著基因芯片技術(shù)的進步，研究者們能夠在更廣泛的基因組范圍內(nèi)篩選與王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的基因。通過對高產(chǎn)蜂種和低產(chǎn)蜂種的基因表達分析，發(fā)現(xiàn)了多個差異表達的基因，這些基因涉及到蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和腺體功能等生物學(xué)過程。特別是幾個上調(diào)表達的基因如dop2、ssrbeta和hex71被認為可能作為蜂王漿高產(chǎn)性狀的分子標記。

8、蜂王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)分子遺傳標記的研究取得了一定的成果，但是仍面臨著一些挑戰(zhàn)和限制。傳統(tǒng)的分子標記方法如rapd-pcr和微衛(wèi)星分析存在篩選范圍較窄，不能全面覆蓋基因組的所有潛在標記的缺陷?；蛐酒夹g(shù)雖然能夠高效地篩選出潛在的分子標記，但是該技術(shù)操作復(fù)雜、成本較高，限制了其在大規(guī)模應(yīng)用中的普及。因此，未來需要采用更加成熟和科學(xué)的分子技術(shù)，以更全面、更精準地研究蜂王漿高產(chǎn)性狀的遺傳基礎(chǔ)。尋找一種操作簡便、可靠性高、成本低的分子標記方法，對于蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。這將為養(yǎng)蜂業(yè)提供科學(xué)的選育策略，幫助提高蜜蜂王漿的生產(chǎn)效率，從而促進蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

9、2、indel技術(shù)

10、indel(insertion-deletion)標記即插入缺失標記，指的是兩種基因型在全基因組中的差異，相對于其中一個基因型而言，另一個基因型的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失。根據(jù)基因組中插入缺失位點，設(shè)計一些特異擴增識別這些插入缺失位點的pcr引物，這就是indel標記，是一類共顯性標記。

11、indel在基因組中分布較廣、密度大、數(shù)目多。就分布的密度而言，平均每953bp就存在一個indel位點，僅次于每268bp就存在一個的snp位點，但遠高于ssr標記位點。snp標記在理論上潛力很大，但由于存在測序后分析結(jié)果模糊的問題，檢測方法及成本的限制，目前僅在人類疾病領(lǐng)域應(yīng)用，在遺傳育種層面并沒有進行廣泛的應(yīng)用。indel標記準確性高、變異穩(wěn)定，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析困難。

12、作為新一代生物技術(shù)，雖然我國的蜂業(yè)科技工作者致力于王漿高產(chǎn)蜜蜂的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)蜂王漿高產(chǎn)機制以及很多與蜂王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的遺傳標記，但是在蜂王漿高產(chǎn)分子標記方面的研究及利用的仍然較少。因此，本方法采用插入缺失標記(indel)技術(shù)對西方蜜蜂成年工蜂蜂王漿高產(chǎn)性狀進行鑒定，據(jù)此可以準確、高效、快速地選擇王漿高產(chǎn)蜜蜂進行育種，甚至為通過基因手段培育更加優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)漿蜂種奠定良好基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種鑒別西方蜜蜂蜂群王漿高產(chǎn)性狀的插入缺失標記nc_037647.1_8674876及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種用于鑒別西方蜜蜂蜂群蜂王漿高產(chǎn)性狀的插入缺失標記nc_037647.1_8674876，所述插入缺失標記nc_037647.1_8674876是西方蜜蜂基因組第10號染色體的第8674876位堿基后插入或缺失14bp的dna片段，所述dna片段的核苷酸序列為5’-ttttacgtagccaa-3’。

4、一種用于檢測上述插入缺失標記nc_037647.1_8674876的引物，所述引物的核苷酸序列如下：primer-f：5'-ccgctacactctcattcgcacc-3'，primer-r：5'--cggcaccgtaattgtcgtcgta-3'；所述引物擴增出的目的條帶大小為574bp。

5、上述的插入缺失標記nc_037647.1_8674876、引物在鑒別西方蜜蜂蜂群蜂王漿高產(chǎn)性狀中的應(yīng)用。

6、上述的插入缺失標記nc_037647.1_8674876、引物在西方蜜蜂育種中的應(yīng)用。

7、一種鑒別西方蜜蜂蜂群蜂王漿高產(chǎn)性狀的方法，其是從待測西方蜜蜂蜂群中隨機收集成年蜜蜂工蜂個體，提取基因組dna；以提取的基因組dna為模板，利用權(quán)利要求2所述的引物進行pcr擴增反應(yīng)，獲得pcr反應(yīng)產(chǎn)物；對獲得的pcr反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將出現(xiàn)目的條帶的pcr反應(yīng)液進行測序；依據(jù)測序結(jié)果進行nc_037647.1_8674876位點基因分型，所述基因型為純合插入型ii、純合缺失型dd或雜合型id，其中i等位基因表現(xiàn)為14bp插入，d等位基因表現(xiàn)為14bp缺失；計算待測西方蜜蜂蜂群nc_037647.1_8674876位點的等位基因頻率，確定待測西方蜜蜂蜂群是否為蜂王漿高產(chǎn)蜂群；

8、當待測西方蜜蜂蜂群的i等位基因頻率pindel與d等位基因頻率pnc無顯著差異時，待測西方蜜蜂蜂群為蜂王漿高產(chǎn)蜂群；當待測西方蜜蜂蜂群的i等位基因頻率pindel顯著大于d等位基因頻率pnc時，待測西方蜜蜂蜂群為蜂王漿低產(chǎn)蜂群；

9、所述pcr擴增的反應(yīng)體系為：pcr反應(yīng)混合物mix?25μl，primer-f?2μl，primer-r?2μl，dna模版1μl，ddh2o?20μl；

10、所述pcr擴增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，共40個循環(huán)；72℃延伸6min。

11、本發(fā)明的有益效果：

12、本發(fā)明采用indel標記nc_037647.1_8674876鑒別蜂群蜂王漿高產(chǎn)性狀是經(jīng)過嚴格的篩選和驗證的。研究采用的樣本來自我國油菜花期江蘇鹽城的一個蜂王漿高產(chǎn)蜂場和一個蜂王漿低產(chǎn)蜂場，在蜂場中分別標記蜂王漿高產(chǎn)群和蜂王漿低產(chǎn)群各100群西方蜜蜂作為實驗蜂群為研究對象，提取蜜蜂樣本的基因組dna，對其進行純度、濃度以及完整性檢測。將質(zhì)量合格的樣品進行文庫構(gòu)建，利用illuminanovaseq?6000pe150測序平臺進行雙端測序，對測序數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和處理。在獲得蜂王漿高低產(chǎn)每個樣本質(zhì)控后的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)后，利用samtools檢測獲得indels。通過θπratio(θπhrjb/θπl(wèi)rjb)分析方法初步篩選出10個與王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的indels。對采集蜂王漿高、低產(chǎn)西方蜜蜂樣本通過pcr和dna測序技術(shù)對初步篩選的indels進行驗證，篩選出nc_037647.1_8674876，作為蜂王漿產(chǎn)量性狀相關(guān)的插入標記。

13、本發(fā)明的顯著優(yōu)點：

14、1、蜂群的產(chǎn)漿能力會受到基因型的影響，而且存在蜂王漿高產(chǎn)蜂群中特定等位基因與蜂王漿產(chǎn)量低的蜂群存在顯著差異。因此通過統(tǒng)計分析待測蜂群的蜜蜂樣本中存在插入片段indel(ttttacgtagccaa)的基因頻率pindel與“非indel插入型”的基因頻率pnc，可以方便、快捷、準確地鑒定蜂群是否具有王漿高產(chǎn)的能力。

15、2、根據(jù)統(tǒng)計指標判斷蜂群的蜂王漿生產(chǎn)能力：當蜂群中存在插入片段indel(ttttacgtagccaa)的基因頻率pindel與“非indel插入型”的基因頻率pnc接近1：1時，此蜂群為蜂王漿高產(chǎn)蜂群；當蜂群中存在插入片段indel(ttttacgtagccaa)的基因頻率pindel顯著大于“非indel插入型”的基因頻率pnc時，此蜂群為蜂王漿低產(chǎn)蜂群。據(jù)此選擇蜂王漿產(chǎn)量高的蜂群，提高蜂群的蜂王漿產(chǎn)量，從而增加蜂農(nóng)的收入。采用本發(fā)明利用蜜蜂蜂王漿高產(chǎn)相關(guān)的indel標記鑒別蜂群蜂王漿高產(chǎn)性狀的方法，可以大大提高效率。

16、3、indel在基因組中分布較廣、密度大、數(shù)目多。就分布的密度而言，平均每953bp就存在一個indel位點，僅次于每268bp就存在一個的snp位點，但遠高于ssr標記位點。snp標記在理論上潛力很大，但由于存在測序后分析結(jié)果模糊的問題，遺傳育種方面并沒有進行廣泛的應(yīng)用。indel標記準確性高、變異穩(wěn)定，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析困難；使用本發(fā)明方法目前主要在實驗室從分子水平掌握蜜蜂的王漿高產(chǎn)機制，檢測與產(chǎn)漿性狀相關(guān)的分子遺傳標記，并結(jié)合分子遺傳標記輔助蜜蜂品種選育技術(shù)，不但能保證選擇的準確性，還可以加快蜜蜂品種選育速度，大大提高了選育王漿高產(chǎn)蜂種的成功率，可以安全、有效、快速地進行王漿高產(chǎn)蜂種的鑒別。