本發(fā)明屬于細胞分離培養(yǎng)，尤其涉及一種豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法。

背景技術：

1、鼻腔作為通往呼吸道的門戶，是抵御微生物入侵的第一道防線，發(fā)揮著關鍵作用。鼻黏膜上皮細胞是先天免疫的重要組成部分，不僅是經典的物理屏障，還能在其它有害物質(病毒、細菌和過敏原等)介導下，通過調控細胞因子的分泌來阻止炎癥的發(fā)展，因此鼻粘膜上皮細胞在呼吸道先天性免疫中，以及由此引發(fā)的繼發(fā)性的細胞結構改變和病理變化中起著重要的作用。

2、粘膜免疫系統(tǒng)(mucosal?immune?system，mis)是機體整個免疫網絡的重要組成部分，包括呼吸道粘膜、胃腸粘膜、生殖道粘膜及眼結膜等外分泌腺體，在抵抗感染方面起著積極重要的作用。黏膜免疫是豬體免疫網絡的重要組成部分，50％以上的淋巴組織和80％的免疫細胞存在于黏膜，黏膜是豬最大的免疫系統(tǒng)。然而，隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬呼吸道疾病日趨嚴重。鑒于鼻粘膜的復雜性，當前對于呼吸道藥物的藥動力學特性的研究大多依賴于動物體內模型和體外組織標本來進行，但急需更為適宜的體外研究模型來減少實驗動物的使用，以符合“3r原則”。目前，體外研究模型主要由人鼻腔上皮細胞或rpmi2650細胞系組成，但兩種模型都無法滿足所有相關要求。雖然初級培養(yǎng)的人鼻上皮的優(yōu)點是存在所有生理細胞類型、有機型結構和類似的蛋白質表達模式。但其缺點也不可忽視，特別是人類來源的細胞材料，壽命有限，細胞的亞培養(yǎng)率低，且供體的個體差異導致細胞狀態(tài)差異顯著，進而影響細胞培養(yǎng)模型的屏障特性形成。雖然使用空氣-液體界面(ali)培養(yǎng)可以增加有機型特性(如粘液和活性纖毛的表達)，但人類鼻粘膜樣品的珍貴性為原代人鼻粘膜上皮細胞的模型建立帶來了極大困難和挑戰(zhàn)。

3、在此背景下，豬作為人類疾病研究的優(yōu)良模型，是實現替代醫(yī)學的不二選擇。然而，當前用于豬上呼吸道疾病研究的感染模型主要是經典的2d細胞系及相關動物模型，均存在諸多缺陷，如細胞來源受限、低保真度和低分化能力以及生長周期長、供不應求、制作成本過高等，所以探索新的病原感染模型迫在眉睫。目前國內外對豬鼻粘膜上皮細胞分離技術研究甚少，主要局限于疾病發(fā)生發(fā)展機制的研究。鑒于此，我們迫切需要開發(fā)一種新型高效的豬鼻粘膜上皮細胞分離方法，用做體外藥物運輸、疾病感染、細胞分化等研究的細胞模型。為此，本發(fā)明提出一種豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，旨在解決上述背景技術中提出的問題。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術方案得以實現：

3、一種豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

4、步驟1、采樣：分離豬上頜，使用75％酒精對組織材料進行消毒，然后于無菌環(huán)境中在15min內取下豬鼻粘膜，將取下的豬鼻粘膜用4℃預冷的含有3抗的無菌pbs清洗3次，并將豬鼻粘膜儲存在含有3抗的dmem/f12(1:1)培養(yǎng)液中；

5、步驟2、豬鼻粘膜上皮細胞的分離：將豬鼻粘膜上皮組織剪碎成2-3mm3大小的組織塊，使用含有3抗的無菌pbs清洗5次后，置于無菌離心管中；向組織塊中加入混合消化酶液進行酶解消化，使標本完全浸泡在混合消化酶液中，4℃消化過夜；次日用預熱的含有10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液終止消化，100μm篩網過濾后，在4℃下以1000rpm/min的轉速離心5min以收集細胞；向細胞沉淀中加入5倍體積的完全培養(yǎng)基，用移液槍輕柔吹打混勻；使用70μm篩網過濾，在4℃下以1000rpm/min的轉速離心5min以收集濾出細胞，將得到的細胞懸液移至新的細胞培養(yǎng)皿中，并在37℃下孵育1h，去除成纖維細胞；收集上層細胞懸液，在4℃下以1000rpm/min的轉速離心5min后，再次向細胞沉淀中加入3倍體積的完全培養(yǎng)基，并用移液槍輕柔吹打混勻；

6、步驟3、豬鼻粘膜上皮細胞的培養(yǎng)：顯微鏡下細胞計數，以5×105/ml的細胞密度將細胞接入新的無菌細胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)基換成鼻粘膜上皮完全培養(yǎng)基，2天換1次液；經過8-10天的培養(yǎng)，細胞長成密度為80％-90％的單層上皮細胞。

7、進一步的，所述3抗由青霉素、鏈霉素和兩性霉素b組成，青霉素濃度為100u/ml，鏈霉素濃度為100μg/ml，兩性霉素b濃度為0.25μg/ml。

8、進一步的，所述dmem/f12培養(yǎng)液的滲透壓為280-320mosm/kg，ph為7.0-7.4。

9、進一步的，所述步驟2中，混合消化酶液由0.5mg/ml膠原酶ⅰ、0.5mg/ml膠原酶ⅳ和0.16mg/ml透明質酸酶組成；混合消化酶液使用體積是豬鼻粘膜組織塊體積的3.5-5倍；酶解消化的消化時間為16-18h；酶解消化溫度為4℃。

10、進一步的，所述步驟2中，用預熱至37℃的含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液終止消化。

11、進一步的，所述步驟2中，完全培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液。

12、進一步的，所述步驟3中，細胞培養(yǎng)皿使用的培養(yǎng)基為含3抗和10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后更換為完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基為含3抗、10％胎牛血清、egf(表皮生長因子)和維生素a的dmem/f12培養(yǎng)液。

13、進一步的，所述egf的濃度為25ng/ml，維生素a的濃度為1ug/ml。

14、與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

15、1、本發(fā)明對豬鼻粘膜組織進行處理，采用混合酶過夜消化法，有效清除粘膜組織黏液，實現更完全的消化。通過差速貼壁技術，獲得純度較高的豬鼻粘膜上皮細胞。并在首次換液時將培養(yǎng)基更換為含egf和維生素a的完全培養(yǎng)基，為上皮細胞提供穩(wěn)定且優(yōu)良的體外生長環(huán)境。該方法不僅快速準確地分離原代細胞，還確保了上皮細胞培養(yǎng)狀態(tài)的穩(wěn)定性和優(yōu)質性。

16、2、本發(fā)明填補了豬鼻粘膜原代細胞分離研究的空白，旨在構建簡單易行、重復性高的原代豬鼻粘膜上皮細胞體外模型，該模型能夠模擬豬鼻粘膜的生理學和形態(tài)學特征，為呼吸道病原體感染機制、呼吸系統(tǒng)疾病藥物篩選和基因療法等研究提供了可靠的體外實驗基礎。

技術特征：

1.一種豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據權利要求1所述的豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述3抗由青霉素、鏈霉素和兩性霉素b組成，青霉素濃度為100u/ml，鏈霉素濃度為100μg/ml，兩性霉素b濃度為0.25μg/ml。

3.根據權利要求1所述的豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述dmem/f12培養(yǎng)液的滲透壓為280-320mosm/kg，ph為7.0-7.4。

4.根據權利要求1所述的豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2中，混合消化酶液由0.5mg/ml膠原酶ⅰ、0.5mg/ml膠原酶ⅳ和0.16mg/ml透明質酸酶組成；混合消化酶液使用體積是豬鼻粘膜組織塊體積的3.5-5倍；酶解消化的消化時間為16-18h；酶解消化溫度為4℃。

5.根據權利要求1所述的豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2中，用預熱至37℃的含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液終止消化。

6.根據權利要求1所述的豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2中，完全培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液。

7.根據權利要求1所述的豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3中，細胞培養(yǎng)皿使用的培養(yǎng)基為含3抗和10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后更換為鼻粘膜上皮完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基為含3抗、10％胎牛血清、egf和維生素a的dmem/f12培養(yǎng)液。

8.根據權利要求1所述的豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3中，鼻粘膜上皮完全培養(yǎng)基中，egf的濃度為25ng/ml，維生素a的濃度為1ug/ml。

技術總結
本發(fā)明適用于細胞分離培養(yǎng)技術領域，提供了一種豬鼻粘膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明采用混合酶過夜消化法，有效清除粘膜組織黏液，實現更完全的消化。通過差速貼壁技術，獲得純度較高的豬鼻粘膜上皮細胞。并在首次換液時將培養(yǎng)基更換為含EGF和維生素A的完全培養(yǎng)基，為上皮細胞提供穩(wěn)定且優(yōu)良的體外生長環(huán)境。該方法不僅快速準確地分離原代細胞，還確保了上皮細胞培養(yǎng)狀態(tài)的穩(wěn)定性和優(yōu)質性。本發(fā)明填補了豬鼻粘膜原代細胞分離研究的空白，旨在構建簡單易行、重復性高的原代豬鼻粘膜上皮細胞體外模型，該模型能夠模擬豬鼻粘膜的生理學和形態(tài)學特征，為呼吸道病原體感染機制、呼吸系統(tǒng)疾病藥物篩選和基因療法等研究提供了可靠的體外實驗基礎。

技術研發(fā)人員：李娜,陳紅,雷連成,鄭雨,李豐陽
受保護的技術使用者：吉林大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/9