本發(fā)明涉及微生物，尤其是涉及一種抑制金黃色葡萄球菌生長的益生菌的篩選方法。

背景技術：

1、金黃色葡萄球菌是一種主要的人類病原體，可引起廣泛的皮膚和軟組織感染，也是菌血癥和器械相關感染的主要原因。同時，金黃色葡萄球菌對環(huán)境有很強的適應能力，可以獲得對抗生素與消毒劑的耐藥性，因此在世界醫(yī)療保健和社區(qū)環(huán)境中廣泛傳播。

2、目前對于皮膚上定植的金黃色葡萄球菌主要還是采用防腐劑或抗生素進行局部治療，但是仍存在不完全去除、局部微生物耗竭的風險，甚至可能增加再感染的風險，還容易誘導耐藥性。益生菌是指在一定的給藥劑量下能對宿主的健康產(chǎn)生積極影響的微生物。相較于防腐劑或抗生素治療，益生菌治療不會誘導共生微生物群耗竭，還可以通過增加皮膚表面菌群多樣性達到改善皮膚健康、抵抗病原體定植和增強宿主對病原體的免疫反應等效果。因此，需要提供一種能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生長的益生菌的篩選方法。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明提出一種抑制金黃色葡萄球菌生長的益生菌的篩選方法，能夠有效篩選得到耐陽離子抗菌肽且對金黃色葡萄球菌具有很好抑菌作用的益生菌。

2、本發(fā)明還提供上述篩選方法篩得的益生菌。

3、本發(fā)明還提供上述篩選方法篩得的益生菌的應用。

4、根據(jù)本發(fā)明的第一方面實施例的一種抑制金黃色葡萄球菌生長的益生菌的篩選方法，包括以下步驟：

5、a1、陽離子抗菌肽耐藥性篩選：

6、制備第一待篩選菌與不同測試濃度的陽離子抗菌肽溶液的第一混合物，孵育，得孵育液；將所述孵育液置于培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至長出單菌落；

7、a2、耐金黃色葡萄球菌性篩選：

8、選擇步驟a1中最高濃度陽離子抗菌肽處理組中的單菌落作為第二待篩選菌，獲取所述第二待篩選菌的代謝物，制備所述代謝物與金黃色葡萄球菌的第二混合物，孵育，檢測所述金黃色葡萄球菌的存活情況；篩選得到符合期望的所述益生菌。

9、根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選方法，至少具有如下有益效果：

10、實施例的篩選方法能夠有效篩選得到耐陽離子抗菌肽且對金黃色葡萄球菌具有很好抑菌作用的益生菌。通過先進行陽離子抗菌肽篩選，步驟簡單，可同時篩選的細菌較多；再進行金黃色葡萄球菌篩選，可以簡化篩選流程，加快篩選速度。通過使用透明的緩沖液稀釋具有陽離子性質(zhì)的抗菌肽，隨后將細菌與稀釋后的抗菌肽混合孵育并定量滴定在哥倫比亞血平板上，該篩選方法不僅克服了抗菌肽與培養(yǎng)基混合后渾濁導致耐抗菌性的測量結(jié)果不精確的問題，還可以根據(jù)培養(yǎng)后平板上細菌的數(shù)量與不添加抗菌肽的對照組對比精確計算抗菌肽對細菌的殺傷能力，提供了一種具有普適性、準確的血平板滴定法測量抗菌肽對細菌的殺傷能力，可以在得到大量數(shù)據(jù)的同時實現(xiàn)連續(xù)篩選的效果，將測量數(shù)據(jù)與細菌篩選有效結(jié)合。該篩選方法結(jié)合測量細菌耐藥性數(shù)據(jù)的方法和篩選具有較強耐藥性的細菌兩種方法，提供了一種能精準測量細菌耐藥能力的同時篩選得到具有較強耐藥能力的實驗方法，為研究細菌耐藥機制或利用細菌在具有高濃度藥物的環(huán)境中進行代謝活動提供便利。

11、通過將實驗中高濃度抗菌肽處理下依舊存活的細菌進行純化、復蘇并重新進行耐藥數(shù)據(jù)測量；在測量實驗中在高濃度抗菌肽處理下依舊存活的細菌可以再純化、復蘇用于下一次耐藥數(shù)據(jù)測量。隨著重復次數(shù)的上升，在實驗中稀釋倍數(shù)也要同樣上升以求得到精確的耐藥數(shù)據(jù)測量結(jié)果。通過重復此過程可以得到具有較強耐藥性的細菌，實現(xiàn)定向篩選的功能。所得到的細菌可設計用于研究耐藥機制和在局部高藥物濃度下發(fā)揮生理功能。

12、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述陽離子抗菌肽溶液為含有陽離子抗菌肽的緩沖液。

13、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述緩沖液為透明緩沖液。由此，利于通過透光度判斷陽離子抗菌肽是否完全溶解；避免非透明的緩沖液可能導致的陽離子抗菌肽局部濃度不同，而影響篩選結(jié)果。

14、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述透明緩沖液選自tris/hcl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、hepes緩沖液或生理鹽水。

15、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述第一待篩選菌為純菌或混合菌。所述第一待篩選菌來源于皮膚。

16、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述第一待篩選菌為人葡萄球菌。

17、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述第一混合物中，所述第一待篩選菌的菌密度為1×104cfu/ml~4×105cfu/ml。例如：可以為1×104cfu/ml、2×104cfu/ml、4×104cfu/ml、6×104cfu/ml、8×104cfu/ml、1×105cfu/ml、2.0×105cfu/ml或4×105cfu/ml。

18、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述陽離子抗菌肽為ll-37。ll-37是一種人體皮膚分泌的抗菌肽。

19、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述第一混合物中，所述抗菌肽的濃度為0.1?μm~1000μm。例如：可以為1000?μm、800?μm、600?μm、400?μm、200?μm、100?μm、80?μm、60?μm、40?μm、20μm、10?μm、5?μm、2.5?μm、1.25?μm、1?μm、0.5?μm或0.1?μm。

20、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a1中孵育的振蕩頻率為120?rpm~240?rpm。例如：可以為120?rpm、140?rpm、160?rpm、180?rpm、200?rpm、220?rpm或240?rpm。

21、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a1中的孵育溫度為25℃~37℃。例如：可以為25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。

22、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a1中的孵育時間為30?min~120?min。例如：可以為30?min、40?min、50?min、60?min、70?min、80?min、90?min、100?min、110?min或120?min。

23、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a1中，所述培養(yǎng)板上分為若干個區(qū)域，一個所述區(qū)域?qū)粋€樣本。所述區(qū)域的形狀包括但不僅限于格狀、扇狀。

24、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述培養(yǎng)板包括哥倫比亞血平板、tsa平板、lb平板中的至少一種。

25、由于皮膚益生菌與金黃色葡萄球菌存在類似的性狀（包括但不限于在固體培養(yǎng)基上形狀與顏色類似、在液體培養(yǎng)基中離心后現(xiàn)象類似等），且金黃色葡萄球菌在實驗中較易污染表皮葡萄球菌并使本領域技術人員難以察覺，通過在篩選過程中使用血平板、分臺實驗以及單獨套袋等操作，保證表皮葡萄球菌亞型單一且不受污染。所有涉及金黃色葡萄球菌的操作需要在單獨的超凈臺中進行，而篩選益生菌的操作需要在另外一臺超凈臺中進行。當涉及益生菌上清液與金黃色葡萄球菌混合時，將益生菌上清液置于ep管中，轉(zhuǎn)移至操作金黃色葡萄球菌的超凈臺中，避免金黃色葡萄球菌對益生菌的污染。

26、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a1中，每個稀釋后的樣本滴于所述培養(yǎng)板上至少三個重復。

27、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a1包括培養(yǎng)前處理；所述培養(yǎng)前處理包括：將所述孵育液進行適當稀釋后，置于培養(yǎng)板上。每個稀釋后的樣本置于所述培養(yǎng)板上至少三個重復。

28、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a1包括培養(yǎng)后處理；所述培養(yǎng)后處理包括：對所述培養(yǎng)板上長出的單菌落進行菌落計數(shù)，并計算殺傷百分比。

29、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，重復所述步驟a1的次數(shù)為3~4次。本領域技術人員可以按需要選擇適合的重復次數(shù)，只要能夠篩選得到具有期望性質(zhì)的第二待篩選菌。隨所述步驟a1重復次數(shù)的增加，樣本的稀釋倍數(shù)也增加。

30、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述第二待篩選菌的數(shù)量為至少1株。本領域技術人員可以按需要選擇適合的株數(shù)。例如：可以為5株、10株或15株。

31、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述第二待篩選菌的代謝物的制備方法包括以下步驟：

32、培養(yǎng)所述第二待篩選菌，得培養(yǎng)液；將所述培養(yǎng)液稀釋至期望的菌密度，去菌體，即得所述代謝物。

33、實施例的代謝物的制備方法完善了代謝物的制備方法，其用于皮膚益生菌的抑菌效能的篩選時，結(jié)合優(yōu)化步驟實現(xiàn)了精準數(shù)據(jù)的獲取，并提升了結(jié)果的可信度。對細菌培養(yǎng)液進行計數(shù)、稀釋，可以排除細菌增殖速率對上清液抗菌物質(zhì)濃度的影響。進一步結(jié)合滴板法可以得到詳細的、大量的抑菌率數(shù)據(jù)，而96孔板法等較難得到詳細數(shù)據(jù)。

34、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，制備所述代謝物時，所述第二待篩選菌的培養(yǎng)時間為12?h~24?h。

35、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，制備所述代謝物時，所述第二待篩選菌的培養(yǎng)的振蕩頻率為120?rpm~240?rpm。例如：可以為120?rpm、140?rpm、160?rpm、180?rpm、200?rpm、220rpm、240?rpm。

36、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，制備所述代謝物時，所述第二待篩選菌的培養(yǎng)溫度為25~37℃。例如：可以為25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。

37、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，制備所述代謝物時，所述期望的菌密度為5×106cfu/ml~4×107cfu/ml。例如：可以為5×106cfu/ml、6×106cfu/ml、7×106cfu/ml、8×106cfu/ml、9×106cfu/ml、1×107cfu/ml、2×107cfu/ml、3×107cfu/ml或4×107cfu/ml。

38、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，制備所述代謝物時，去菌體的方法包括但不限于離心、過濾。

39、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，制備所述第二混合物時，將所述第二待篩選菌的代謝物與所述金黃色葡萄球菌的菌懸液按體積比1：0.9~1.1混合，得到所述第二混合物。

40、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a2包括：將容納所述第二混合物的容器密封后（如：采用密封袋和/或封口膜）進行孵育。

41、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述第二混合物中，所述金黃色葡萄球菌的菌密度為1×104cfu/ml~4×105cfu/ml。例如：可以為1×104cfu/ml、2×104cfu/ml、4×104cfu/ml、6×104cfu/ml、8×104cfu/ml、1×105cfu/ml、2.0×105cfu/ml或4×105cfu/ml。

42、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a2中的孵育溫度為25℃~37℃。例如：可以為25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。

43、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，步驟a2中的孵育時間為30?min~120?min。例如：可以為30?min、40?min、50?min、60?min、70?min、80?min、90?min、100?min、110?min或120?min。

44、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，重復所述步驟a2的次數(shù)為5~6次。

45、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，篩選得到符合期望的所述益生菌的標準包括：所述益生菌具有穩(wěn)定的金黃色葡萄球菌殺滅能力。

46、根據(jù)本發(fā)明的第二方面實施例的一種益生菌，由上述第一方面實施例中的所述篩選方法篩選得到。

47、根據(jù)本發(fā)明的第三方面實施例的如上述第二方面實施例所述的益生菌在b1）~b3）中任一項中的用途；

48、b1）制備抗第一方面實施例中所述的抗菌肽的產(chǎn)品；

49、b2）制備殺滅和/或抑制金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品；

50、b3）殺滅和/或抑制金黃色葡萄球菌。

51、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述產(chǎn)品選自試劑、試劑盒或藥物。

52、根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述用途為非疾病診斷治療目的。

53、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實施本發(fā)明而了解。