本發(fā)明涉及基因工程，尤其涉及一種提高植物逆境抗性的融合基因、其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物逆境抗性是植物對(duì)抗不良外部因素，比如抗旱、抗鹽堿、抗?jié)场⒖癸L(fēng)、抗凍、抗病蟲害等的能力。

2、在自然界條件下，由于不同的地理位置和氣候條件以及人類活動(dòng)等多方面原因，造成了各種不良環(huán)境，超出了植物正常生長(zhǎng)、發(fā)育所能忍受的范圍，致使植物受到傷害甚至死亡，這些對(duì)植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境稱為逆境或脅迫，而植物對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗力為抗逆性或逆境抗性。

3、隨著全球氣候變化和環(huán)境惡化，植物在生長(zhǎng)過程中面臨著高溫、鹽堿等多種逆境的威脅。這些逆境嚴(yán)重影響了植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大挑戰(zhàn)。因此，通過分子育種提高植物的多重逆境抗性，對(duì)于保障糧食安全、優(yōu)化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，推動(dòng)農(nóng)業(yè)向綠色、高效、可持續(xù)方向發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決相關(guān)技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種提高植物逆境抗性的融合基因；本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種融合基因的構(gòu)建方法；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種融合基因的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)第一個(gè)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：

3、一種提高植物逆境抗性的融合基因 ，所述融合基因的核苷酸序列如seq?no.1所示，融合基因從5’端至3’端的核苷酸序列如下所示：

4、ggatccagtgtaaatggatagccacccacccactcctctcgtataatgtaaatttctcatttttttaatgatgccaaatccatataatcggaatttcaaccaccgtatttgggctatagatcataactaaagttatggaaataaatgaataaattaaaaaatgttaagtagaaaaaataagtatcaacaagagagaaggaagaagaagacataagctaacagttgtccgaaattgattttggcaaaaggtgatctttgattttgcttaaaacatcgaatcagaacatttaatttagttgtttcctcatttctttcatctatggagtttagtatacccaataaatttgattagttacttattccagctcctattattatatttaacacacataatgtaaaacagacgcgtataatttatatagaaactgtatgtagttaaaaacgacatactagtactgatgactctttgtttacgtaaatttgtattctcaaagaaaaaaagtaactaccttttgttatggtctctaagaaaaaacaaaagtactttacagttttcttagtgaccattctgtaagaatatcaaatagtgaaaaataggtaaacgagaatctttttttctgtgtaacaatattgtattagtgaaggattattaattacgagactattatctaaaacgcattagtgacccttttggatttaaatcgtagcagccgactaaaccaaaatatttagaaagttttccaaaaacaaacaacattaaaacacatttaaactcgtacacaataatagaaactaaactatttttagcagactaaagtctaaacaacattacgtttaaaaattgataatcagtgttttatagaactggcgatctcctaaagatgaaccaccgagaagtttcaagataaaaacaaaaataaaaatagccaaacactcttatctattcatccatttgcaggtcaatgacaccgtatttttccacaatcgaatcttccttattctttacacaaacttcttctctgtatgtaagtaaactaatattaaaattgaacttgtcaaagactttcctcttggtcacgtctgctatatatactccttcattcacacaaatgtttaactccaacacacttctctttctctcaacctctctccctctctctctccgattgtgtttttagagctgtcacgtgtcacgtgtcaggttcgaagctctaagaaaaaactgcagatgggtcttcctctaatgatggagagatcatcaaacaacaacaacgtcgagctttctcgagtggcggtttcagacactcacggcgaagactcaccgtacttcgccggctggaaagcttacgacgaaaatccttacgacgaatctcataacccttccggtgtcatccaaatgggtctcgctgagaatcaggtctcgtttgatcttcttgaaacttacttggagaagaagaatccagaaggttcgatgtggggatcaaaaggagctcctgggttccgtgaaaacgcattgtttcaagactaccacggtctcaaaactttcagacaagccatggctagtttcatggaacagattcgaggaggcaaagctagatttgatcctgaccggatcgtcctcaccgccggagccaccgccgctaacgaactcttaactttcattctcgccgatcctaacgacgcccttctagttcccacaccgtattatccaggattcgatagagatttgagatggagaaccggagtgaaaatagtacccatccactgcgacagctcgaaccatttccagataaccccggaggcgctagagtcggcgtaccaaacggctcgtgacgcgaacattagagtccgaggagtgctcataaccaacccatcgaacccattaggggcgacggtccaaaagaaggttctagaagatctccttgacttctgcgtacgcaagaatattcacttggtctcagacgagatctactccggctccgtcttccatgcctccgagttcacaagcgttgccgagatcgtagaaaacatagatgacgtgtcagtaaaggaacgagttcacatcgtctacagtctctccaaggatcttggtcttcctggtttccgcgtgggaactatatactcgtacaacgataatgttgttcggacagcgagaaggatgggcatgtttgcagcagtttcaaacgacactcagcatatgctggcttctatgttgtcggatgaggagtttacggagaagtacattaggataaaccgggaaagacttagaagacggtacgataccattgtggaagggcttaagaaggcagggattgagtgtttgaaagggaacgcagggctattttgttggatgaatttgggtttcttgctcgaaaagaaaactaaagacggcgagctccagctttgggatgtgatcttaaaggagctgaacctgaatatatctccgggatcttcgtgccactgctcggaggtcggatggtttagggtttgttttgctaatatgagtgagaacactttggagattgcgttgaagagaatacatgagttcatggaccgacgaaggaggttttacccatacgatgttccagattacgcttgaggtgacc；

5、進(jìn)一步地，所述逆境抗性包括鹽堿抗性和高溫抗性。

6、為了實(shí)現(xiàn)第二個(gè)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：

7、一種融合基因的構(gòu)建方法，所述融合基因?yàn)樯鲜鎏岣咧参锬婢晨剐缘娜诤匣?，所述融合基因命名? ar1，包括 ar1-1和片段 ar1-2的克隆與融合構(gòu)建，包括如下步驟：

8、s100、以 his-r10為模板，擴(kuò)增片段 ar1-1-1，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pmd18-t載體得到 ta-ar1-1-1-ha；

9、s200、從 ta-ar1-1-1-ha質(zhì)粒中以 ar1-1-f2和 ar1-1-r2為引物擴(kuò)增片段 ar1-1，以擬南芥基因組為模板， ar1-2-f和 ar1-2-r為引物，在上下游分別引入 bamhi和 psti酶切位點(diǎn)，采用pcr擴(kuò)增的方法克隆片段 ar1-2；

10、s300、用 bamhi和 ecoo65i?( bsteii)酶切 pcambia3301載體，將pcr擴(kuò)增后的片段 ar1-1、片段 ar1-2和酶切后的 pcambia3301載體用無(wú)縫克隆技術(shù)同源重組得到融合基因 ar1，所述融合基因 ar1連接在 pcambia3301載體骨架上得到 ar1-p3301。

11、進(jìn)一步地，步驟s100中擴(kuò)增所使用的引物分別為 ar1-1-f和 ar1-1-r， ar1-1-f核苷酸序列從5’端至3’端如seq?no.2所示， ar1-1-r核苷酸序列從5’端至3’端如seq?no.3所示；

12、seq?no.2如下所示：

13、ctgcagatgggtcttcctctaatgatggaga；

14、seq?no.3如下所示：

15、ggtcacctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaaaacctccttc。

16、為了實(shí)現(xiàn)第三個(gè)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：

17、一種融合基因的應(yīng)用，所述融合基因?yàn)樯鲜鎏岣咧参锬婢晨剐缘娜诤匣?，所述?yīng)用包括利用上述融合基因的構(gòu)建方法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化或提高植物逆境抗性的育種。

18、進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟：

19、s400、使用 ar1-p3301轉(zhuǎn)化gv1301農(nóng)桿菌，得到攜帶有融合基因 ar1的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；

20、其中，所述育種為利用所述轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌進(jìn)行育種，包括以下步驟：

21、s500、利用轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染受體植物外植體或花序的方法獲得轉(zhuǎn)基因植株，得到攜帶有融合基因 ar1的t0代種子。

22、進(jìn)一步地，步驟s400中，包括將得到的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌使用含有抗生素的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以篩選出成功導(dǎo)入融合基因 ar1的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；

23、其中所述培養(yǎng)基不做具體限定，例如所述培養(yǎng)基可以采用含有卡那霉素、慶大霉素和利福平的lb平板培養(yǎng)基。

24、進(jìn)一步地，還包括如下步驟：

25、s600、將t0代種子用抗生素或除草劑，進(jìn)行抗性篩選，得到成功轉(zhuǎn)入融合基因 ar1的t1代種子；

26、所述抗性篩選不做具體限定，例如，可以進(jìn)行basta抗性篩選。

27、進(jìn)一步地，所述育種包括農(nóng)作物和園藝作物的育種。

28、進(jìn)一步地，所述農(nóng)作物包括但不限于水稻、小麥、玉米、棉花、大豆、油菜、馬鈴薯、水果和蔬菜中的至少一種，所述園藝作物包括但不限于林木和花卉中的至少一種。

29、本發(fā)明實(shí)施例中的上述一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案，至少具有如下技術(shù)效果之一：

30、本發(fā)明提供的提高植物逆境抗性的融合基因 ar1，可以在顯著促進(jìn)植株生長(zhǎng)的同時(shí)，大幅提高植物對(duì)高溫和鹽堿的抗性，可廣泛應(yīng)用于具有多重逆境抗性的作物新品種培育等領(lǐng)域，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明還提供了一種融合基因的構(gòu)建方法，根據(jù)該構(gòu)建方法可以成功構(gòu)建出上述提高植物逆境抗性的融合基因 ar1，該方法操作簡(jiǎn)便、條件易于控制，有利于廣泛推廣和使用。

31、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。