背景技術(shù)：

1、透明質(zhì)酸，又稱玻尿酸、玻璃酸，英文名hyaluronicacid，簡稱ha，是一種糖胺聚糖，由葡糖醛酸(glcua)和n-乙酰氨基葡糖(glcnac)交替連接而成，它是無臭無味的白色無定形固體，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，具有良好的黏彈性和假塑流變性，透明質(zhì)酸廣泛分布于動物組織、植物和微生物中，在人體的皮膚、臍帶、眼玻璃體及關(guān)節(jié)滑液中含量較高，具有重要的生理功能，例如：在皮膚中，能鎖住水分，使皮膚光滑細(xì)嫩，維持皮膚彈性，在人體關(guān)節(jié)滑液中主要成分為透明質(zhì)酸，起到潤滑關(guān)節(jié)，保護(hù)軟骨，增強(qiáng)運動能力等多種功能，透明質(zhì)酸的功能與其分子量密切相關(guān)，根據(jù)分子量大小，可分為以下幾類：高分子量透明質(zhì)酸：分子量高于2000kda，能夠在皮膚表層形成一層透氣膜，在皮膚表面鎖住水分，防止水分蒸發(fā)，但穿透力差，不會被皮膚吸收；中等分子量透明質(zhì)酸：分子量在500kda-2000kda之間，也可在皮膚表層形成透氣膜，鎖住水分，緊致皮膚；低分子量透明質(zhì)酸：分子量在10kda-500kda之間，可滲透到皮膚的真皮層，鎖住水分，促進(jìn)皮膚代謝，但防止水分蒸發(fā)的能力較差。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種低分子量的透明質(zhì)酸鈉及其應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的傳統(tǒng)透明質(zhì)酸效果較為單一的問題。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種低分子量透明質(zhì)酸，所述低分子量透明質(zhì)酸的分子量為500-2000da；

3、是通過表面修飾的多孔納米材料固定透明質(zhì)酸水解酶制得固定化酶，再將固定化酶加入到500kda-2000kda的普通分子量透明質(zhì)酸溶液中制備；

4、一種如權(quán)利要求1所述的低分子量透明質(zhì)酸在制備具有抗皺緊致、紫外線損傷修復(fù)、舒緩抗炎、抗氧化功能的化妝品中的應(yīng)用

5、一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法：包括以下步驟：

6、s1.制備透明質(zhì)酸水解酶；

7、s2.對多孔納米材料的表面進(jìn)行修飾；

8、s3.對透明質(zhì)酸水解酶的固定化；

9、s4.進(jìn)行酶解反應(yīng)；

10、s5.通過離心去除固定化酶并終止反應(yīng)；

11、s6.固定化酶經(jīng)過離心沉淀，直接重復(fù)用于下一次酶解反應(yīng)，固定化酶的活性通過定期檢測以評估其使用壽命和重復(fù)使用效果。

12、優(yōu)選的，所述s1包括如下步驟：

13、1、將表達(dá)水蛭來源的透明質(zhì)酸水解酶的畢赤酵母接種于含抗生素的ypd平板；

14、2、挑取平板中過夜培養(yǎng)的單克隆，接種于含有ypd的培養(yǎng)基；

15、3、收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液放入離心機(jī)中，利用離心力使固體顆粒沉淀；上清液則為初步處理后的液體；

16、4、采用膜過濾進(jìn)一步去除微小的固體顆粒和雜質(zhì)并通過高壓勻漿破壁，釋放胞內(nèi)產(chǎn)物；

17、5、添加乙醇沉淀出目標(biāo)產(chǎn)物，利用反滲透膜或納濾膜等進(jìn)行濃縮產(chǎn)物并收集濃縮液，得到透明質(zhì)酸水解酶。

18、優(yōu)選的，所述s2包括如下步驟：

19、1、將多孔納米材料置于適量去離子水中，超聲分散10分鐘，通過離心沉淀納米材料，分離除棄上清液，重復(fù)清洗三次；

20、2、在10ml去離子水中加入適量的表面修飾劑并混合均勻；

21、3、加入清洗后的多孔納米材料，室溫下輕輕攪拌12小時，使表面修飾劑與納米材料表面發(fā)生反應(yīng)

22、4、反應(yīng)結(jié)束后，離心收集納米材料，并用去離子水反復(fù)清洗，直至上清液無色透明，確保去除未反應(yīng)的修飾劑。

23、優(yōu)選的，所述s3包括如下步驟：

24、1、將透明質(zhì)酸水解酶溶解在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中；

25、2、將修飾后的多孔納米材料按照與酶10:1的質(zhì)量比懸浮在酶溶液中；

26、3、室溫下攪拌6-12小時，使酶與材料表面發(fā)生物理吸附或共價鍵結(jié)合；

27、4、通過離心沉淀固定化酶的多孔納米材料，棄去上清液，用適量緩沖溶液反復(fù)洗滌固定化酶的納米材料，確保去除未結(jié)合的酶。

28、優(yōu)選的，所述s4包括如下步驟：

29、1、將普通分子量透明質(zhì)酸溶解在適當(dāng)?shù)乃?，濃度控制?0-20mg/ml。

30、2、將一定量的固定化酶加入到透明質(zhì)酸溶液中，控制反應(yīng)條件在37℃、攪拌速度300rpm下反應(yīng)1-6小時，以獲得特定分子量的透明質(zhì)酸。

31、優(yōu)選的，所述s5包括如下步驟：

32、1、通過離心分離出固定化酶的納米材料，收集上清液；

33、2、將上清液通過超濾膜進(jìn)行超濾，分離不同分子量的透明質(zhì)酸；

34、3、進(jìn)一步通過透析或凝膠滲透色譜純化得到目標(biāo)分子量的透明質(zhì)酸；

35、4、純化后的透明質(zhì)酸溶液通過冷凍干燥獲得粉末形式的透明質(zhì)酸。

36、優(yōu)選的，所述多孔納米材料為介孔二氧化硅、碳納米管或金屬有機(jī)框架中的一種，所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液，所述表面修飾劑為氨基硅烷或戊二醛中的一種，所述離心轉(zhuǎn)速為10000rpm，且離心時間為10min。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：該低分子量透明質(zhì)酸：

38、1、通過測定低分子量透明質(zhì)酸作用于人真皮成纖維細(xì)胞后i型膠原蛋白的含量，0.5％樣品濃度與空白對照組相比，col1基因相對表達(dá)量增加了0.22倍，且基因相對表達(dá)具有顯著性差異(*p<0.05)，證明添加該濃度低分子量透明質(zhì)酸的樣品具有抗皺、緊致作用。

39、2、通過檢測細(xì)胞的活力來評價低分子量透明質(zhì)酸具有抗紫外損傷功效，與模型組(100.00％)相比，添加0.001％低分子量透明質(zhì)酸濃度的樣品細(xì)胞增殖率為119.92％，顯著高于模型組(*p<0.05)，該測試濃度的樣品證明低分子量透明質(zhì)酸具有紫外線損傷修復(fù)功效。

40、3、本發(fā)明所述的低分子量透明質(zhì)酸，在0.05％樣品測試濃度下，細(xì)胞中的炎癥因子no抑制率為9.48％，表明該濃度樣品可以顯著抑制no的分泌，證明低分子量透明質(zhì)酸具有支持舒緩抗炎效果。

41、4、本發(fā)明所述的低分子量透明質(zhì)酸，在0.05％樣品測試濃度下，ros抑制率為29.19％，該濃度樣品對細(xì)胞中ros具有顯著的抑制作用，證明低分子量透明質(zhì)酸具有抗氧化效果。

技術(shù)特征：

1.一種低分子量透明質(zhì)酸，其特征在于：所述低分子量透明質(zhì)酸的分子量為500-2000da。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低分子量透明質(zhì)酸納，其特征在于：是通過表面修飾的多孔納米材料固定透明質(zhì)酸水解酶制得固定化酶，再將固定化酶加入到500kda-2000kda的普通分子量透明質(zhì)酸溶液中制備。

3.一種如權(quán)利要求1所述的低分子量透明質(zhì)酸在制備具有抗皺緊致、紫外線損傷修復(fù)、舒緩抗炎、抗氧化功能的化妝品中的應(yīng)用。

4.一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：所述s1包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：所述s2包括如下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：所述s3包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：所述s4包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：所述s5包括如下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于：所述多孔納米材料為介孔二氧化硅、碳納米管或金屬有機(jī)框架中的一種；所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液，所述表面修飾劑為氨基硅烷或戊二醛中的一種；所述離心轉(zhuǎn)速為10000rpm，且離心時間為10min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明用于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種低分子量的透明質(zhì)酸鈉及其應(yīng)用，所述低分子量透明質(zhì)酸的分子量為500?2000Da。該低分子量透明質(zhì)酸，通過測定低分子量透明質(zhì)酸作用于人真皮成纖維細(xì)胞后I型膠原蛋白的含量，0.5％樣品濃度與空白對照組相比，COL1基因相對表達(dá)量增加了0.22倍，且基因相對表達(dá)具有顯著性差異(*P<0.05)，證明添加該濃度低分子量透明質(zhì)酸的樣品具有抗皺、緊致作用，通過檢測細(xì)胞的活力來評價低分子量透明質(zhì)酸具有抗紫外損傷功效，與模型組(100.00％)相比，添加0.001％低分子量透明質(zhì)酸濃度的樣品細(xì)胞增殖率為119.92％，該測試濃度的樣品證明低分子量透明質(zhì)酸具有紫外線損傷修復(fù)功效。

技術(shù)研發(fā)人員：王哲,楊曉波,張劍,王紅偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇弘康未來營養(yǎng)科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6