本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種腈水解酶突變體，腈水解酶及其突變體在催化蓖麻堿降解中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蓖麻是世界十大油料作物之一，蓖麻餅粕是蓖麻籽榨油后產(chǎn)生的殘渣，占比約為50％。蓖麻餅粕具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)最為豐富占比大約35％，這些蛋白質(zhì)除此之外還含有鈣磷和鉀等礦物元素。因此蓖麻餅粕作為肥料或飼料添加具有很大的應(yīng)用前景。我國作為全世界種植蓖麻作物面積最廣的國家之一，工業(yè)榨油必定會產(chǎn)生大量的蓖麻餅粕，如果這些餅粕能夠廣泛應(yīng)用于飼料和肥料領(lǐng)域，將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

2、由于蓖麻餅粕中含有蓖麻堿(n-甲基-3-氰基-4-甲氧基-2-吡啶酮)、蓖麻毒蛋白和變應(yīng)原等有毒物質(zhì)，使其在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用受到了極大限制，這些物質(zhì)會對禽畜造成傷害嚴(yán)重時可能會致死。因此如何去除餅粕中的有毒物質(zhì)是目前的主要研究方向，蓖麻毒蛋白和變應(yīng)原會在高溫下變性失活從而失去毒性，一般在加熱榨取的工藝后含量幾乎為零。而蓖麻堿相對于毒蛋白來說更加穩(wěn)定，因此也更加難以去除，目前蓖麻堿的去除有物理法、化學(xué)法和生物法。

3、物理法和化學(xué)法去除蓖麻堿雖然工藝簡單，但是由于去除過程中會有高溫高壓、加入有機(jī)試劑等工藝操作，會使蓖麻餅粕中的營養(yǎng)物質(zhì)損耗，而且耗能大對環(huán)境不友好。而生物法更加經(jīng)濟(jì)安全，工藝條件更溫和，主要是通過篩選自然界中能夠降解轉(zhuǎn)化蓖麻堿的微生物，這些微生物能夠在代謝過程中利用蓖麻堿作為碳源或氮源，在其生長繁殖過程中降解蓖麻堿。微生物對蓖麻堿的降解一般是通過將氰基水解為羧基來實(shí)現(xiàn)的：

4、

5、目前已知的能夠降解氰基的菌有假單胞菌、芽孢桿菌、硝化桿菌等，有研究者通過在富集培養(yǎng)基中加入蓖麻堿，將土壤樣本用無菌水混勻后接入培養(yǎng)基中，經(jīng)過多次篩選得到一株具有降解蓖麻堿能力的假單胞菌，可以去除蓖麻餅粕中70％以上的蓖麻堿。然而，微生物降解蓖麻堿通常耗時較長，降解效率不高，且降解不徹底。因此，有必要開發(fā)一種更高效的生物降解蓖麻堿的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中生物法降解蓖麻堿效率低且降解不徹底的問題，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用腈水解酶降解蓖麻堿的方法，并對腈水解酶進(jìn)行突變，獲得了一種高活性的腈水解酶突變體，并利用該突變體的基因工程菌作為催化劑用于蓖麻餅粕中蓖麻堿的降解，催化活力為野生型的842倍。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：來源于streptomyces?lunaelactis或streptomyceshokutonensis的腈水解酶在催化蓖麻堿降解中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：以含有腈水解酶編碼基因的基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎后提取的腈水解酶粗酶液作為催化劑，加入蓖麻堿或含有蓖麻堿的蓖麻餅粕，構(gòu)成反應(yīng)體系，將蓖麻堿水解為n-甲基-3-羧基-4-甲氧基-2-吡啶酮。

3、微生物降解蓖麻堿通常耗時較長，且降解不徹底，而直接酶催化降解省去了微生物在反應(yīng)體內(nèi)生長所需的時間，更加高效便利。因此，發(fā)明人團(tuán)隊嘗試?yán)秒嫠饷附到獗吐轱炂芍械谋吐閴A，并通過活力篩選，發(fā)現(xiàn)了來源于鏈霉菌屬的streptomyceslunaelactis或streptomyces?hokutonensis的腈水解酶具有蓖麻堿降解活力。故本發(fā)明提出了將來源于streptomyces?lunaelactis或streptomyces?hokutonensis的腈水解酶應(yīng)用于催化蓖麻堿降解中，將蓖麻堿氰基水解為羧基的同時保留蓖麻餅粕中的營養(yǎng)物質(zhì)，且反應(yīng)條件溫和。

4、為進(jìn)一步提高腈水解酶對蓖麻堿降解效率，本發(fā)明通過建立高通量篩選方法，構(gòu)建突變體文庫，篩選出獲得具有催化活力顯著提高的突變體。因此，本發(fā)明還提供了腈水解酶突變體，所述腈水解酶突變體由streptomyces?lunaelactis來源的腈水解酶其氨基酸序列第165、190和221號進(jìn)行單點(diǎn)突變或多點(diǎn)聯(lián)合突變獲得。

5、作為優(yōu)選，所述streptomyces?lunaelactis來源的腈水解酶其氨基酸序列如seqid?no.2所示，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

6、作為優(yōu)選，所述腈水解酶突變體是由seq?id?no.2所示的氨基酸序列第165位色氨酸突變?yōu)楦拾彼?，?或第190位絲氨酸突變?yōu)樯彼?，?或第221位纈氨酸突變?yōu)槔野彼岖@得的；更優(yōu)選地，所述腈水解酶突變體是由seq?id?no.2所示的氨基酸序列第165位色氨酸突變?yōu)楦拾彼?，和?90位絲氨酸突變?yōu)樯彼?，和?21位纈氨酸突變?yōu)槔野彼岖@得的。

7、作為優(yōu)選，所述腈水解酶突變體的氨基酸序列為seq?id?no.4、seq?id?no.6、seqid?no.8中的一種，更優(yōu)選為seq?id?no.8。

8、本發(fā)明還提供了編碼所述腈水解酶突變體的基因。

9、作為優(yōu)選，所述腈水解酶突變體的核苷酸序列為seq?id?no.3、seq?id?no.5、seqid?no.7中的一種，更優(yōu)選為seq?id?no.7。

10、本發(fā)明還提供了含有所述腈水解酶突變體編碼基因的重組載體。

11、本發(fā)明還提供了含有所述腈水解酶突變體編碼基因的基因工程菌。

12、本發(fā)明還提供了所述腈水解酶突變體在催化蓖麻堿降解中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：以含有腈水解酶突變體編碼基因的基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎后提取的腈水解酶突變體粗酶液作為催化劑，加入蓖麻堿或含有蓖麻堿的蓖麻餅粕，優(yōu)選以ph7～8緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，構(gòu)成反應(yīng)體系，優(yōu)選在25～50℃更優(yōu)選為35℃、400～600rpm條件下進(jìn)行反應(yīng)，將蓖麻堿水解為n-甲基-3-羧基-4-甲氧基-2-吡啶酮。其中，所述反應(yīng)體系中，蓖麻堿的濃度為10～100mm，更優(yōu)選為50mm；所述緩沖液為ph?7.0、100mm的pb緩沖液。

13、本發(fā)明還提供了所述腈水解酶突變體在飼料中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：以含有腈水解酶突變體編碼基因的基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎后提取的腈水解酶突變體粗酶液作為催化劑，將濕菌體以0.1～1g/kg蓖麻餅粕的添加量加入純水中重懸均勻，加入蓖麻餅粕，優(yōu)選在ph?7～8，30～40℃條件下反應(yīng)12～36h，獲得降毒后的蓖麻餅粕。

14、其中，所述濕菌體可按如下方法制備：

15、(1)將含有所述腈水解酶或腈水解酶突變體編碼基因的基因工程菌接種至含50μg/ml卡那霉素的固體lb固體培養(yǎng)基，經(jīng)37℃過夜活化，獲得單菌落；

16、(2)將單菌落接種到含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h；

17、(3)以體積濃度2％的接種量接種到新鮮的含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中37℃、180rpm培養(yǎng)至od600為0.6～0.8，加入終濃度為0.1mm的異丙基-β-d硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside，iptg)，28℃、180rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，取培養(yǎng)液在8000rpm，4℃下離心，收集沉淀即獲得濕菌體。

18、其中，所述粗酶液可按如下方法制備：按照濕菌體50g/l的用量重懸于ph7.0、100mm?pb緩沖液中，在冰水混合物上超聲破碎10min(功率為400w，破碎2s，間隔1s)，將所得菌體破碎液8000rpm下離心，取上清液獲得含有腈水解酶或腈水解酶突變體的粗酶液。

19、本發(fā)明的有益效果：

20、(1)本發(fā)明通過建立高通量篩選方法，首先篩選出具有發(fā)現(xiàn)了具有蓖麻堿降解活力的streptomyces?lunaelactis或streptomyces?hokutonensis來源的腈水解酶，再進(jìn)一步構(gòu)建了streptomyces?lunaelactis來源的腈水解酶的突變體文庫，篩選獲得具有催化活力顯著提高的腈水解酶突變體，其中活力最高的組合突變體w165g/s190w/v221y，酶活是野生型腈水解酶的842倍。

21、(2)本發(fā)明以含腈水解酶突變體基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或粗酶液為催化劑降解蓖麻餅粕中蓖麻堿，經(jīng)24h后，蓖麻堿含量從0.2％降低至0.01％，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到95％，實(shí)現(xiàn)了對蓖麻堿的高效徹底降解，有利于蓖麻餅粕在飼料、肥料領(lǐng)域的應(yīng)用。