背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個方面，本公開提供了產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)的方法，其包括從受試者獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)；將ipsc分化為神經(jīng)祖細(xì)胞(npc)；在攪拌生物反應(yīng)器中的懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)npc以形成寡球；使用酶處理和機(jī)械攪拌將寡球解離成單個少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)；以及在逐步冷凍過程中冷凍保存單個opc。

2、在一些實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器是葉輪驅(qū)動的dasbox微型生物反應(yīng)器。在一些實(shí)施方案中，dasbox微型生物反應(yīng)器具有100rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))的轉(zhuǎn)速持續(xù)約1小時，然后400rpm持續(xù)約2小時。

3、在一些實(shí)施方案中，葉輪驅(qū)動的dasbox微型生物反應(yīng)器的攪動導(dǎo)致冷凍保存后高的解凍后細(xì)胞活力。

4、在一些實(shí)施方案中，酶處理包括在hbss中稀釋的1x?accumax和2xtryple?select或在hbss(漢克斯平衡鹽溶液)中稀釋的4x?tryple?select。在一些實(shí)施方案中，酶處理不包括添加外源dna酶i。

5、在一些實(shí)施方案中，npc在懸浮培養(yǎng)中分化約60天。在一些實(shí)施方案中，opc在約第60天表達(dá)譜系標(biāo)志物cd9、o4、sox10、olig2和nkx2.2。在一些實(shí)施方案中，npc在懸浮培養(yǎng)中分化約20天、約25天、約30天、約35天、約40天、約45天、約50天、約55天、約60天、約65天、約70天、約75天、約80天、約85天、約90天、約95天、約100天、約105天、約110天、約115天或約120天。

6、在另一方面，本公開提供了治療脫髓鞘疾病或病癥的方法，其包括將少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(opc)施用到待治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，允許施用的少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(opc)植入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，從而恢復(fù)由opc以及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞支持的功能。在另一方面，本公開提供了治療脫髓鞘疾病的方法，其包括將少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(opc)施用到待治療受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，允許施用的少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(opc)植入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，從而恢復(fù)髓鞘堿性蛋白(mbp)的表達(dá)。

7、在一些實(shí)施方案中，可擴(kuò)展分化平臺產(chǎn)生功能性少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，其中opcs在體外約60天內(nèi)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，opc由神經(jīng)祖細(xì)胞(npc)分化而來。

8、在一些實(shí)施方案中，在可擴(kuò)展分化平臺中，npc在懸浮培養(yǎng)中分化以形成寡聚球。在一些實(shí)施方案中，懸浮培養(yǎng)在葉輪驅(qū)動的微型生物反應(yīng)器中。

9、在一些實(shí)施方案中，在葉輪驅(qū)動的微型生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的寡聚球允許細(xì)胞產(chǎn)量擴(kuò)增約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍和約10倍和球體的物理均勻性。

10、在一些實(shí)施方案中，opc在約第60天表達(dá)譜系標(biāo)志物cd9、o4、sox10、olig2和nkx2.2。

11、在一些實(shí)施方案中，乳酸脫氫酶釋放在球體解離期間用作細(xì)胞健康指標(biāo)。

12、在一個方面，本公開提供了通過以下方法產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，所述方法包括從受試者獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)，將ipsc分化為神經(jīng)祖細(xì)胞(npc)，在攪拌生物反應(yīng)器中的懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)npc以形成寡聚球，使用酶處理和機(jī)械攪拌將寡聚球解離成單個少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，以及在逐步冷凍過程中冷凍保存單個opc。

13、在另一方面，本公開提供了少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，其中在生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞(npc)體外分化后約60天，所述opc表達(dá)譜系標(biāo)志物cd9、o4、sox10、olig2和nkx2.2。

14、在另一方面，本公開提供了少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，其中所述opc受wnt調(diào)節(jié)。

15、在一些實(shí)施方案中，少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(opc)在約60天為sox10和o4陽性。

16、在一些實(shí)施方案中，在約40天至約60天之間添加wnt調(diào)節(jié)劑后，少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(opc)在第60天sox10和o4陽性細(xì)胞的百分比增加至>50％。

技術(shù)特征：

1.產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)的方法，包括：從受試者獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)；將ipsc分化為神經(jīng)祖細(xì)胞(npc)；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物反應(yīng)器是葉輪驅(qū)動的dasbox微型生物反應(yīng)器。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述dasbox微型生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為100rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))持續(xù)約1小時，然后400rpm持續(xù)約2小時。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中葉輪驅(qū)動的dasbox微型生物反應(yīng)器的攪拌導(dǎo)致冷凍保存后高的解凍后細(xì)胞活力。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶處理包括在hbss中稀釋的1x?accumax和2xtryple?select或在hbss(漢克斯平衡鹽溶液)中稀釋的4xtryple?select。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶處理不包括dnase?i處理。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述npc在所述懸浮培養(yǎng)中分化約60天。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述opcs在第60天表達(dá)譜系標(biāo)志物cd9、o4、sox10、olig2和nkx2.2。

9.治療脫髓鞘疾病的方法，包括：

10.用于產(chǎn)生功能性少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)的可擴(kuò)展分化平臺，其中所述opcs在體外約60天內(nèi)產(chǎn)生。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可擴(kuò)展分化平臺，其中所述opc從神經(jīng)祖細(xì)胞(npc)分化而來。

12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可擴(kuò)展分化平臺，其中所述npc在懸浮培養(yǎng)中分化以形成寡球。

13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可擴(kuò)展分化平臺，其中所述懸浮培養(yǎng)在葉輪驅(qū)動的微型生物反應(yīng)器中。

14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可擴(kuò)展分化平臺，其中在所述葉輪驅(qū)動的微型生物反應(yīng)器中生成的所述寡聚球允許細(xì)胞產(chǎn)量擴(kuò)增4倍以及球體的物理均勻性。

15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可擴(kuò)展分化平臺，其中所述opcs在約60天內(nèi)表達(dá)譜系標(biāo)志物cd9、o4、sox10、olig2和nkx2.2。

16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可擴(kuò)展分化平臺，其中乳酸脫氫酶釋放在球體解離期間用作細(xì)胞健康指標(biāo)。

17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可擴(kuò)展差異化平臺，其中所述可擴(kuò)展差異化平臺是封閉系統(tǒng)。

18.通過以下方法產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，所述方法包括：從受試者獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)；

19.少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，其中所述opcs在生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞(npc)體外分化后約60天表達(dá)譜系標(biāo)志物cd9、o4、sox10、olig2和nkx2.2。

20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，其中所述opc受wnt調(diào)節(jié)。

21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，其中所述opc在約60天是sox10和o4陽性的。

22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(opc)，其中在約40天至約60天之間通過添加wnt調(diào)節(jié)劑，第60天sox10和o4陽性細(xì)胞的百分比增加至>50％。

技術(shù)總結(jié)
本公開涉及產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(OPC)的方法。此外，還公開了使用少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(OPC)治療脫髓鞘疾病的方法。

技術(shù)研發(fā)人員：L·斯塔里科夫,J·舒,T·庫蒂阿,M·艾伯爾,M·湯米希瑪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：藍(lán)巖治療有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9