本發(fā)明涉及腫瘤的免疫治療領(lǐng)域，尤其涉及一種基因工程化細(xì)菌外泌體及在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤免疫治療是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究方向，旨在通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，啟動(dòng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，發(fā)揮抗腫瘤療效。腫瘤新生抗原(neoantigen)是一類腫瘤細(xì)胞的基因組非同義突變產(chǎn)生的由腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白或多肽，能在機(jī)體中誘導(dǎo)強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，具有特異性強(qiáng)、副作用弱、安全性高等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)，基于腫瘤新生抗原的個(gè)性化免疫治療模式被認(rèn)為是未來實(shí)體瘤免疫治療的主要發(fā)展方向。國(guó)內(nèi)外多個(gè)臨床試驗(yàn)的結(jié)果均揭示了以腫瘤新生抗原為靶點(diǎn)研發(fā)的腫瘤新生抗原疫苗在多種癌癥治療中的有效性和應(yīng)用前景。研究表明，腫瘤新生抗原疫苗單藥治療雖可促使特異性淋巴細(xì)胞由外周血向腫瘤部位遷移，提升腫瘤組織中的免疫浸潤(rùn)，改善腫瘤免疫微環(huán)境，但同時(shí)也觀察到新生抗原特異性淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)pd-1、tim-3、ctla-4等受體，使免疫反應(yīng)受到抑制，引起腫瘤免疫逃逸。因此，在接受新生抗原疫苗治療，增加腫瘤內(nèi)部新生抗原特異性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的同時(shí)，聯(lián)合免疫抑制療法來抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，可能是進(jìn)一步提升腫瘤新生抗原疫苗療效的關(guān)鍵手段。

2、mica/b是nkg2d的配體之一，廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面。自然殺傷細(xì)胞可通過其表面表達(dá)的nkg2d受體來識(shí)別腫瘤細(xì)胞并激活對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷程序，同時(shí)t淋巴細(xì)胞也可通過與腫瘤細(xì)胞表面的mica/b結(jié)合來釋放共刺激信號(hào)，間接激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。但腫瘤細(xì)胞通過分泌金屬蛋白酶或外泌體分泌的方式來誘導(dǎo)細(xì)胞表面mica/b蛋白的水解脫落，釋放可溶性mica/b蛋白來阻斷免疫細(xì)胞的識(shí)別殺傷，抑制免疫反應(yīng)，形成免疫逃逸。最近，有研究人員發(fā)現(xiàn)，針對(duì)micbα3結(jié)構(gòu)域的抗體能在體內(nèi)很好的抑制腫瘤細(xì)胞表面micb蛋白的脫落，顯著增加腫瘤細(xì)胞表面micb蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤免疫逃逸。鑒于micb在人類多種癌癥細(xì)胞表面高度表達(dá)，基于micbα3結(jié)構(gòu)域的抗體或許可作為一種腫瘤相關(guān)抗原(taa),結(jié)合腫瘤新生抗原疫苗療法，進(jìn)一步增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的功能，避免腫瘤免疫逃逸，從而獲得更好的免疫治療療效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種遞送蛋白的細(xì)菌外泌體囊泡，包括一種基因工程化細(xì)菌外泌體囊泡neo-micbomvs，表面載有由腫瘤新生抗原蛋白和micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白組成的融合蛋白。靶向抗原提呈細(xì)胞，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的激活，增加腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤(rùn)，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，提高腫瘤免疫治療的效果。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體攜帶編碼融合蛋白的核酸，所述編碼融合蛋白的核酸含有編碼大腸桿菌clya蛋白的核酸一、編碼micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白的核酸二、編碼fc蛋白的核酸三、編碼抗原的核酸四和連接核酸一、核酸二、核酸三和核酸四的核酸五，所述核酸五用于編碼furin蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。

3、所述表達(dá)載體是非致病性病毒載體。

4、所述核酸一如seq?id?no.1所示，所述核酸二如genbank:uik24483.1所示，所述核酸三如seq?id?no.2所示，所述抗原包括腫瘤抗原，所述腫瘤抗原包括腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原，所述furin蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列為rgrkrrs。

5、所述腫瘤新生抗原包括基于小鼠肝癌細(xì)胞系hepa1-6的7條短肽基因序列，所述編碼腫瘤新生抗原的核酸四如seq?id?no:3所示。

6、所述編碼融合蛋白的核酸含有如seq?id?no:4所示的核苷酸序列。

7、一種基因工程化細(xì)菌外泌體，所述外泌體囊泡的表面載有或可分泌所述表達(dá)載體表達(dá)的融合蛋白。

8、所述融合蛋白由腫瘤新生抗原蛋白、micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白、fc蛋白和furin蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)組成。

9、一種制備基因工程化細(xì)菌外泌體囊泡的方法，包括如下制備步驟：

10、(1)外泌體囊泡制備：將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，并在lb平板中過夜培養(yǎng)，取單克隆菌落在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

11、(2)外泌體囊泡提?。喝〔襟E(1)中培養(yǎng)完成的lb培養(yǎng)基，離心去除培養(yǎng)基中的大腸桿菌，將上清液過濾，并在超速離心機(jī)中離心，收集外泌體。

12、所述的細(xì)菌外泌體囊泡均來源于工程化大腸桿菌rosetta菌株，細(xì)菌膜表面表達(dá)有腫瘤新生抗原蛋白和micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白。所述的細(xì)菌外泌體囊泡由大腸桿菌rosetta分泌，通過超速離心獲得。

13、本發(fā)明首先將大腸桿菌clya蛋白基因序列、腫瘤新生抗原蛋白基因序列、micbα3蛋白基因序列和fc蛋白基因序列插入pet28a空載質(zhì)粒中，并在3’端插入3×ha序列得到質(zhì)粒(pet28a-clya-neo-micb-fc)。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌rosetta菌株中，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，通過超速離心提取細(xì)菌外泌體，最后通過western?blot驗(yàn)證融合蛋白的表達(dá)情況。

14、具體的，所述載有目的融合蛋白的細(xì)菌外泌體囊泡由如下方法構(gòu)建獲得：

15、(1)外泌體囊泡制備：將大腸桿菌clya蛋白基因序列、腫瘤新生抗原蛋白基因序列、micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白基因序列和fc蛋白基因序列通過柔性肽序列鏈接構(gòu)成新的融合蛋白基因序列，再插入到pet28a空載質(zhì)粒(或其他用于表達(dá)融合蛋白空載質(zhì)粒)中，獲得pet28a-clya-neo-micb-fc質(zhì)粒，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌rosetta，并在添加有kanamycin的lb平板中過夜培養(yǎng)，取單克隆菌落在添加有kanamycin的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基od值在0.6～0.8之間時(shí)加入iptg繼續(xù)培養(yǎng)。

16、(2)外泌體囊泡提?。喝∨囵B(yǎng)完成的lb培養(yǎng)基，離心去除培養(yǎng)基中的大腸桿菌rosetta，將上清液依次在0.45nm和0.22nm的濾頭中過濾，并在超速離心機(jī)中離心，收集外泌體，使用蛋白定量bca法進(jìn)行總蛋白定量，可通過western?blot檢測(cè)目的融合蛋白的表達(dá)，證明載有腫瘤新生抗原和micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白的融合蛋白的細(xì)菌外泌體囊泡成功構(gòu)建。

17、本發(fā)明運(yùn)用基因工程策略將腫瘤新生抗原蛋白基因序列、micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白基因序列和fc蛋白基因序列用furin蛋白酶切割序列連接組成融合蛋白基因序列，并在大腸桿菌rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)以得到細(xì)菌外泌體囊泡neo-micbomvs。外泌體囊泡中攜帶的融合蛋白可在體內(nèi)被furin蛋白酶切割得到腫瘤新生抗原蛋白和micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白。腫瘤新生抗原蛋白可被抗原提呈細(xì)胞處理并將抗原信息呈遞至t淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)新生抗原特異性t細(xì)胞的激活，特異性識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞；micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白可被b細(xì)胞吞噬，并誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)micbα3結(jié)構(gòu)域蛋白的抗體，該抗體可與腫瘤細(xì)胞表面的micb蛋白結(jié)合，阻止micb蛋白的脫落，抑制相關(guān)免疫逃逸機(jī)制；fc蛋白可增加外泌體囊泡與靶細(xì)胞的結(jié)合能力，促進(jìn)外泌體囊泡的吞噬；外泌體囊泡具有l(wèi)ps等多種病原體相關(guān)分子模式，可以激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗原交叉提呈作用，輔助腫瘤新生抗原發(fā)揮作用。

18、本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供所述的細(xì)菌外泌體囊泡在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤為所述腫瘤患者的腫瘤。

19、本發(fā)明構(gòu)建的neo-micbomvs外泌體囊泡可激活患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)新生抗原特異性t細(xì)胞產(chǎn)生并大量浸潤(rùn)至腫瘤組織中，發(fā)揮抗腫瘤效果，同時(shí)可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生micbα3抗體，該抗體和與腫瘤細(xì)胞表面的micb蛋白特異性結(jié)合，組織micb蛋白的水解脫落，防止腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。二者的聯(lián)合作用，可在激活抗腫瘤免疫、增加特異性t細(xì)胞浸潤(rùn)的基礎(chǔ)上抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，進(jìn)一步提升免疫治療療效。

20、本發(fā)明構(gòu)建的neo-micbomvs外泌體囊泡可通過任何已知的遞送方式方法給藥：靜脈注射，動(dòng)脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，胃腸外，肺腔內(nèi)，局部給藥的區(qū)域遞送形式。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主要優(yōu)勢(shì)和有益效果主要體現(xiàn)在：

22、(1)本發(fā)明所構(gòu)建的細(xì)菌外泌體囊泡來源于生物體內(nèi)，與目前其他具有腫瘤細(xì)胞免疫治療的納米材料相比，該種外泌體囊泡具有良好的生物相容性、較低毒副作用、較強(qiáng)的特異性等優(yōu)勢(shì)。且該種外泌體囊泡遞送策略能保留蛋白分子的生物活性。

23、(2)本發(fā)明提供的外泌體囊泡組合物針對(duì)目前癌癥免疫治療患者響應(yīng)率低、客觀緩解率不盡人意的困境提出了新的解決方案。

24、(2)制備工藝簡(jiǎn)單，可大批量快速制備，所需設(shè)備為常規(guī)設(shè)備。