本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、自身免疫性肝炎(autoimmune?hepatitis，aih)是一種自身免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致的慢性炎癥性肝臟疾病，可迅速進(jìn)展成肝硬化和肝功能衰竭。aih以自身免疫細(xì)胞攻擊肝細(xì)胞為主，血清自身抗體陽(yáng)性和免疫球蛋白g水平升高為其特點(diǎn)，肝組織學(xué)上以界面性肝炎、肝細(xì)胞玫瑰花結(jié)樣改變等主要特點(diǎn)。同時(shí)，68％～81％的aih患者存在維vd3不足(vd3＜30nmol/l)，約20％的aih患者存在嚴(yán)重vd3缺乏(vd3＜25nmol/l)。嚴(yán)重的vd3缺乏癥與aih治療無(wú)反應(yīng)和疾病進(jìn)展等不良事件密切相關(guān)。

2、目前，主要采用非特異性免疫抑制劑(潑尼松)聯(lián)合硫唑嘌呤治療或者潑尼松治療作為aih的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。但至少有10％～15％的患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療方案應(yīng)答不佳，另有部分患者因不能耐受藥物副作用或停藥造成復(fù)發(fā)。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，如庫(kù)欣綜合征和骨質(zhì)疏松等。隨著aih發(fā)病率逐年升高，部分患者表現(xiàn)出對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療應(yīng)答欠佳或不耐受的情況，加大了aih的治療難度。因此，aih亟需新的治療策略和手段。

3、臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(uc-msc)是一種多能干細(xì)胞，具有低免疫原性、易獲取、易體外培養(yǎng)及多向分化潛能等特點(diǎn)，臨床已用于移植物抗宿主病、難治型系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種免疫相關(guān)疾病的治療。近年來(lái)，越來(lái)越多證據(jù)顯示uc-msc在治療肝臟疾病中具有積極作用，抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)及具有向肝細(xì)胞分化等特性使其成為治療肝病的新方法。uc-msc主要是通過(guò)與不同類型的免疫細(xì)胞直接相互作用，和釋放各種免疫調(diào)控活性分子或含有不同活性因子外泌體，發(fā)揮其免疫調(diào)控功能。

4、外泌體是具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑為30-200nm，可攜帶母細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)、脂類和rna等重要信息的納米級(jí)囊泡。uc-msc來(lái)源的外泌體可調(diào)控固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過(guò)抑制t淋巴細(xì)胞功能，降低b細(xì)胞活化、增殖與分泌，影響巨噬細(xì)胞分化與樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，抑制自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)控作用，從而提高uc-msc外泌體衍生藥物遞送載體的壽命和藥物的生物利用度。而且，越來(lái)越多的證據(jù)顯示uc-msc相比其他細(xì)胞能產(chǎn)生大量的外泌體。因此，uc-msc來(lái)源的外泌體具有優(yōu)異的特性。

5、vd3是一種脂溶性維生素，在體內(nèi)通過(guò)皮膚表面的7-脫氫膽固醇在紫外線照射下經(jīng)熱異構(gòu)作用轉(zhuǎn)變而來(lái)，其與vd3結(jié)合蛋白(dpd)結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，在25-羥化酶(cyp2r1)作用下生成25(oh)vd3，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至腎臟，在近端小管通過(guò)1α-羥化酶(cyp27b1)，產(chǎn)生其最終活性形式骨化三醇(1，25(oh)2vd3)。越來(lái)越多的研究表明，vd3不僅有調(diào)節(jié)骨代謝和鈣穩(wěn)態(tài)作用的經(jīng)典途徑，還有免疫介導(dǎo)、抗氧化、抗纖維化及抗炎作用的非經(jīng)典途徑。

6、在哺乳動(dòng)物組織器官中，肝臟駐留巨噬細(xì)胞占比最大，是調(diào)控肝臟天然免疫優(yōu)勢(shì)的重要免疫細(xì)胞，在肝臟免疫耐受穩(wěn)態(tài)維持與失衡過(guò)程中具有重要地位。因此，靶向巨噬細(xì)胞而治療自身免疫性肝炎是一種理想的新策略。

7、通過(guò)構(gòu)建能夠靶向巨噬細(xì)胞的工程化外泌體，調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型和功能，進(jìn)而改善受損的肝細(xì)胞，用于aih的治療，為aih治療提供一種新的策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述問(wèn)題的缺陷和不足，提供一種靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體制備方法及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種工程化裝載vd3外泌體的制備方法。

3、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能夠靶向調(diào)控巨噬細(xì)胞的工程化外泌體。

4、本發(fā)明的第三目的是提供所述工程化外泌體在aih中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

6、本發(fā)明提供一種靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體制備方法及其應(yīng)用，具體包括以下步驟：

7、s1：使用超速離心法提取uc-msc培養(yǎng)上清，沉淀即為外泌體。

8、s2：將步驟s1得到的外泌體通過(guò)共孵育的方式進(jìn)行裝載vd3，通過(guò)超速離心去除游離的vd3。

9、s3：將步驟s2得到的工程化外泌體應(yīng)用于靶向調(diào)控巨噬細(xì)胞和自身免疫性疾病的治療。

10、優(yōu)選地，步驟s1中外泌體來(lái)源于p4～p6代干細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)超速離心所得。

11、優(yōu)選地，步驟s2中工程化改造外泌體通過(guò)外泌體與vd3共孵育所得。

12、優(yōu)選地，步驟s2共孵育的條件為：200μg外泌體與100μg?vd3在振蕩儀進(jìn)行孵育(37℃，190rpm，2h)。最后通過(guò)超速離心去除游離的vd3。

13、本發(fā)明提供一種工程化裝載vd3的外泌體，由上述方法制備得到。

14、本發(fā)明提供所述靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體在自身免疫性肝炎治療藥物中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明具有以下有益效果：

16、本發(fā)明提供了一種靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體，利用巨噬細(xì)胞的吞噬作用，激活巨噬細(xì)胞的ahr受體，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型和功能。該工程化外泌體能夠重編程m1型巨噬細(xì)胞為m2型巨噬細(xì)胞，降低tnf-α、inf-γ、il-1β和il-6炎性細(xì)胞因子，并且能促進(jìn)il-22釋放。il-22能夠改善肝細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)其增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，工程化外泌體能夠明顯改善自身免疫性肝炎癥狀，對(duì)全身器官無(wú)損傷，可克服傳統(tǒng)糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制類藥物的帶來(lái)的副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體制備方法及其應(yīng)用，其特征在于，具體包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，外泌體為p4～p6代uc-msc培養(yǎng)上清通過(guò)超速離心所得。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，工程化外泌體為外泌體與vd3共孵育所得。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，vd3為25(oh)vd3或(1，25(oh)2vd3)或其衍生物。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，共孵育的條件為：200μg外泌體與100μg?vd3在振蕩儀進(jìn)行孵育(37℃，190rpm，2h)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，載藥量為1.05％。

7.一種靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體制備方法及其應(yīng)用，其特征在于，有權(quán)利要求1～5任一所述方法制備得到。

8.權(quán)利要求7所述工程化外泌體作為高效靶向巨噬細(xì)胞的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求7所述工程化外泌體能激動(dòng)巨噬細(xì)胞中ahr受體，促進(jìn)il-22功能細(xì)胞因子釋放。

10.權(quán)利要求7所述工程化外泌體在制備自身免疫性肝炎藥物上的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的工程化外泌體制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建了能裝載維生素D3的人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，利用巨噬細(xì)胞的吞噬作用，激活巨噬細(xì)胞的AhR受體，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型和功能。該工程化外泌體能重編程M1型巨噬細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞，降低TNF?α、INF?γ、IL?1β和IL?6炎性細(xì)胞因子，并且能促進(jìn)IL?22釋放。IL?22能夠改善肝細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)其增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，工程化外泌體能夠明顯改善自身免疫性肝炎癥狀，對(duì)全身器官無(wú)損傷，可克服傳統(tǒng)糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制類藥物的帶來(lái)的副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：沈萍萍,田強(qiáng),黃亞紅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9