本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及一種多肽。

背景技術(shù)：

a型激酶錨定蛋白(a-kinaseanchorproteins,akaps)是結(jié)合蛋白激酶a(pka)亞基的一組結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)。大量的證據(jù)表明akaps在camp介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用。akap3是一個(gè)癌睪抗原。研究表明，akap3是精子特有的基因，主要在精子形成過(guò)程中減數(shù)分裂后表達(dá)，在精子前體細(xì)胞的形態(tài)變化和調(diào)節(jié)精子功能中起重要作用。在正常組織中，akap3表達(dá)僅存在于睪丸中。akap3的mrna在各種腫瘤細(xì)胞系中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，akap3在卵巢癌中高表達(dá)，并且akap3的表達(dá)和腫瘤的組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，也與腫瘤的臨床分期有關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種靶向akap3的親和肽或akap3來(lái)源的抗腫瘤ctl表位肽p333及其應(yīng)用。

一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

另一方面，本發(fā)明提供了所述多肽的制備方法，該多肽可通過(guò)固相合成制得，如采用標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案制備。

另一方面，本發(fā)明提供了含所述多肽的食物、保健品或藥物組合物，藥物組合物可包括多肽及其藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其形式可為疫苗。

再一方面，本發(fā)明提供了所述多肽用于制備akap3表達(dá)陽(yáng)性腫瘤的預(yù)防性或治療性多肽疫苗的用途。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的多肽是akap3抗腫瘤ctl(細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞)表位肽，較好地誘導(dǎo)特異性ctl應(yīng)答，提升ifn-γ的表達(dá)量，從而增強(qiáng)腫瘤預(yù)防和治療的效果，可制為一種新型的腫瘤治療性疫苗甚至食物、保健品。

附圖說(shuō)明

圖1表征elispot法檢測(cè)表位肽體外特異性ctl分泌ifn-γ的能力；

圖2表征ldh法檢測(cè)表位肽體外特異性ctl細(xì)胞毒性；

圖3表征elispot法檢測(cè)表位肽體內(nèi)特異性ctl分泌ifn-γ的能力；

圖4表征ldh法檢測(cè)表位肽體內(nèi)特異性ctl細(xì)胞毒性；

圖5表征elisa法檢測(cè)小鼠血清中ifn-γ的分泌量；

圖6為轉(zhuǎn)基因小鼠體重變化圖。

各圖中所涉*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001分別代表實(shí)驗(yàn)組與pbs組的顯著性差異；▲p<0.05，▲▲p<0.01和▲▲▲p<0.001分別代表實(shí)驗(yàn)組與hbcag18–27或者th表位組的顯著性差異。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的候選肽p333，其序列為lidsflrnl(leu-ile-asp-ser-phe-leu-arg-asn-leu)，如seqidno.1所示，采用標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案進(jìn)行固相合成，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)其分子量為：1091.7[m+h]，基本同理論值1090.3。下面鑒定該候選肽(有時(shí)亦稱(chēng)表位肽)的活性，所用實(shí)驗(yàn)方法、試劑均為常規(guī)選擇，參見(jiàn)文獻(xiàn)：shirr,liuj,zouz,qiym,zhaimx,zhaiwj,gaoyf:theimmunogenicityofanovelcytotoxictlymphocyteepitopefromtumorantigenpl2l60couldbeenhancedby4-chlorophenylalaninesubstitutionatposition1.cancerimmunology,immunotherapy:cii2013,62(11):1723-1732。如無(wú)特別說(shuō)明，所涉名詞、縮寫(xiě)均為本領(lǐng)域常規(guī)含義。

1.t2a2細(xì)胞親和力實(shí)驗(yàn)

①收集t2a2細(xì)胞，用無(wú)血清imdm洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶/ml，鋪于24孔板中，1ml/孔。實(shí)驗(yàn)組加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，50μm的候選肽p333；設(shè)置陽(yáng)性組、陰性組、背景對(duì)照組。于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中共孵育18h。

②收集孵育后的細(xì)胞，用冰pba洗3次，加入0.5ml1:100稀釋的單克隆抗體bb7.2，4℃避光孵育30min。

③冷pba洗3次，加入50μl稀釋度為1:50的fitc-羊抗鼠igg溶液，4℃避光孵育40min。冷pba洗滌1次，1mlpba重懸，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，設(shè)置已被鑒定的hbcag18-27作為結(jié)合力和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性肽，pbs作為陰性對(duì)照，未加肽刺激的單純t2a2細(xì)胞作為背景對(duì)照。

結(jié)果用熒光系數(shù)(fi)表示：熒光系數(shù)(fi)＝(表位肽平均熒光強(qiáng)度－背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果分析：如果fi>1.5：候選肽與hla-a*0201具有強(qiáng)親合力；1.5>fi>0.5：中等親合力；fi<0.5：弱親合力。

經(jīng)分析，本肽的fi＝2.86。

2.肽/mhc復(fù)合物穩(wěn)定性分析

收集t2a2細(xì)胞，用無(wú)血清imdm洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶/ml，鋪于24孔板中，1ml/孔。分別加入50μm的候選肽，設(shè)置陽(yáng)性組、陰性組、背景組和調(diào)零組，每孔加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中共孵育18h。

孵育完成后，以冷pba洗滌3次以洗凈未結(jié)合的肽，加入10μg/mlbrefeldina(布雷菲德菌素a)孵育1h。以0h、2h、4h、6h為時(shí)間點(diǎn)，37℃、5％co²共孵育。冷pba洗滌2次，加500μl稀釋度為1:100的單克隆抗體bb7.2，4℃避光孵育30min。冷pba洗滌2次，加50μl稀釋度為1:50的fitc-羊抗鼠igg，4℃避光孵育40min。冷pba洗滌后，pba重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果以dc50表示。

經(jīng)檢測(cè)，dc50>6h。

3.體外免疫活性檢測(cè)

細(xì)胞毒t淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)

①40ml離心管中加入適量肝素鈉溶液，抽取hla-a2陽(yáng)性健康志愿者外周血20ml，無(wú)菌ph＝7.2的pbs將抗凝血進(jìn)行稀釋。

②將4ml的淋巴細(xì)胞分裂液貼壁緩緩加入無(wú)菌的離心管，隨后加入經(jīng)pbs稀釋過(guò)的抗凝血，注意不要打破界面。2000rpm，離心20min。

③離心結(jié)束后，離心管中細(xì)胞從上至下分為四層；棄去第一層血漿層，吸取第二層環(huán)狀乳白色的淋巴細(xì)胞層，置于另一無(wú)菌離心管中，隨后加入5倍體積的pbs洗滌，2000rpm，15min。

④棄上清，收集沉淀。用含10％胎牛血清的imdm培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/ml，置于24孔板中培養(yǎng)。

⑤設(shè)定pbs組、hbv組、實(shí)驗(yàn)組，第2天hbv組、實(shí)驗(yàn)組分別加入相對(duì)應(yīng)的多肽和β2-m(兩者終濃度均設(shè)為10μg/ml)，pbs組加入相對(duì)應(yīng)的pbs，第3天加入50u/ml的重組人源il-2(rhil-2)，觀察培養(yǎng)液狀態(tài)，進(jìn)行半量換液，補(bǔ)加rhil-2。每7天進(jìn)行一輪重復(fù)刺激，刺激過(guò)程：24孔板進(jìn)行1000rpm，10min離心，去除上清，加入新鮮的含10％胎牛血清的imdm培養(yǎng)基，同時(shí)補(bǔ)加上述量相對(duì)應(yīng)的多肽、rhil-2和β2-m，第2輪刺激的第3天加入cd3抗體。

⑥完成3輪刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，收集細(xì)胞即作為效應(yīng)ctl。

免疫活性檢測(cè)

1)elispot(enzyme-linkedimmunospotassay酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn))法檢測(cè)分泌ifn-γ的t細(xì)胞數(shù)

a.首先進(jìn)行預(yù)包被板的活化：

取出所需elispot板條，每孔加200μl無(wú)血清的imdm培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10min后將培養(yǎng)基棄去；

b.細(xì)胞鋪板：

誘導(dǎo)的ctl作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的t2a2作為刺激細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為2×10⁶個(gè)/ml；實(shí)驗(yàn)孔每孔加50μl效應(yīng)細(xì)胞和50μl刺激細(xì)胞；

陰性對(duì)照孔每孔加100μl無(wú)血清的imdm培養(yǎng)基；

陽(yáng)性對(duì)照孔每孔加50μl的效應(yīng)細(xì)胞和10μlpha再補(bǔ)加40μl無(wú)血清的imdm培養(yǎng)基培養(yǎng)。

鋪板完畢放于培養(yǎng)箱中，37℃、5％co2孵育18h；

c.細(xì)胞裂解：

孵育結(jié)束后，傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200μl無(wú)菌的去離子水，4℃裂解細(xì)胞10min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200μl1×washingbuffer進(jìn)行洗滌，洗滌6次，每次停留60s，洗滌完畢后，在吸水紙上拍干；

d.加入檢測(cè)抗體孵育：

加入100μl生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育1h；孵育完成后，傾盡孔內(nèi)液體，加入200μl1×washingbuffer進(jìn)行洗滌，洗滌6次，每次停留60s，洗滌完畢后，在吸水紙上拍干；

e.加入酶聯(lián)親和素孵育：

加入100μl酶聯(lián)親和素，37℃孵育1h；孵育完成后，傾盡孔內(nèi)液體，每孔加入200μl1×washingbuffer進(jìn)行洗滌，洗滌6次，每次停留60s，洗滌完畢后，在吸水紙上拍干；

f.顯色：

加入100μl現(xiàn)配的aec顯色液，室溫25℃避光靜置30min，進(jìn)行顯色；顯色完成后，傾盡孔內(nèi)液體并打開(kāi)孔板底座，去離子水洗滌，終止顯色。置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；用elispot圖像分析儀計(jì)數(shù)96孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)，結(jié)果比較如圖1所示。

2)ldh(lactatedehydrogenase乳酸鹽脫氫酶)法檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

①靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞的準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)中將sw620作為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁵個(gè)/ml，每孔加入5000個(gè)/50μl，加入不同數(shù)量和體積的效應(yīng)細(xì)胞(前面體外誘導(dǎo)制備)，使實(shí)驗(yàn)組形成不同的效靶比(分別為12.5:1、25:1、50:1)，并補(bǔ)加無(wú)血清的imdm培養(yǎng)基至總體積100μl，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

同時(shí)設(shè)立以下對(duì)照：

靶細(xì)胞自發(fā)釋放組

靶細(xì)胞最大釋放組

效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組

背景對(duì)照組

總體積校正對(duì)照組，各對(duì)照組也設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔總體積100μl。

②ldh實(shí)驗(yàn)步驟：

細(xì)胞培養(yǎng)板96孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。孵育結(jié)束前45min，加入10μl10×裂解液添加在靶細(xì)胞最大釋放孔和體積校正孔中。培養(yǎng)結(jié)束后，離心培養(yǎng)板1000rpm，10min；取出96孔板，每孔輕輕吸取50μl上清置于另一96孔板對(duì)應(yīng)的孔中，全部轉(zhuǎn)移結(jié)束后，每孔迅速加入50μl乳酸脫氫酶底物混合液，室溫避光孵育30min；孵育結(jié)束后，每孔添加50μl終止液；酶標(biāo)儀上以490nm檢測(cè)吸收od值，計(jì)算殺傷率。

殺傷率＝(實(shí)驗(yàn)組釋放-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放)/(靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋)×100％。

結(jié)果比較如圖2所示。

4.akap3的hla-a2.1/k^b轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)免疫活性檢測(cè)

效應(yīng)ctl的體內(nèi)誘導(dǎo)

隨機(jī)選取6～8周齡hla-a2.1/k^b轉(zhuǎn)基因小鼠，每組5只，雌雄隨機(jī)分配。

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置pbs組、th表位組、實(shí)驗(yàn)組。每組注射小鼠體內(nèi)的劑量如下：

pbs組：pbs：弗氏不完全佐劑(ifa)＝1:1

th組：pbs：th表位：弗氏不完全佐劑(ifa)＝1:1:2

實(shí)驗(yàn)組：實(shí)驗(yàn)組：th表位：弗氏不完全佐劑(ifa)＝1:1:2

第1次免疫注射記為第0天，按照上面所給各個(gè)組分進(jìn)行皮下免疫注射，在第5d、第10d時(shí)進(jìn)行第2次和第3次加強(qiáng)免疫；同時(shí)每次免疫注射前，對(duì)hla-a2.1/k^b轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行觀察，記錄體重，結(jié)果如圖6所示。

制備效應(yīng)細(xì)胞：

①將免疫注射后的hla-a2.1/k^b轉(zhuǎn)基因小鼠于第11d脫頸處死，置于75％酒精中，浸泡處理10min消毒后，無(wú)菌開(kāi)腹腔取出脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織放于200目不銹鋼網(wǎng)篩中；

②培養(yǎng)皿中加入少量ph＝7.2的pbs，并將200目鋼網(wǎng)置于其上，用20ml醫(yī)用注射器內(nèi)芯進(jìn)行研磨，盡量研磨干凈。pbs沖洗，移去篩網(wǎng)，培養(yǎng)皿中得脾細(xì)胞懸液(約10ml)，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中；

③1000rpm、10min水平離心，棄上清，收集細(xì)胞；每管加入5ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打重懸細(xì)胞，4℃孵育15min裂解紅細(xì)胞；1000rpm、10min水平離心棄上清，收集細(xì)胞。pbs洗滌2次；

④將脾細(xì)胞重懸于10ml含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)后的脾細(xì)胞懸液置于6孔板中培養(yǎng)，每孔5ml細(xì)胞懸液；次日每孔加入250u重組鼠源il-2、β2-m以及與相對(duì)應(yīng)的多肽；在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，收獲后作為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行elispot和ldh檢測(cè)。elispot和ldh檢測(cè)方法同前面體外免疫實(shí)驗(yàn)所用方法，elispot法檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，ldh法檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。

hla-a2.1/k^b轉(zhuǎn)基因小鼠血清中ifn-γ酶聯(lián)免疫分析(elisa)

在轉(zhuǎn)基因小鼠脫頸處死之前，用眼球取血的方法取各組免疫小鼠靜脈血，室溫靜置2-4h后，3000rpm離心10分鐘取上層血清，標(biāo)記好后-80℃保存。elisa法檢測(cè)小鼠血清中ifn-γ抗體水平，結(jié)果比較如圖5所示。

序列表

<110>漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校

<120>靶向akap3的親和肽p333

<160>1

<210>1

<211>9

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

leuileaspserpheleuargasnleu

15