本發(fā)明屬于納豆食品開發(fā)領(lǐng)域，特別是涉及一種納豆菌培養(yǎng)基及其優(yōu)化方法。

背景技術(shù)：

納豆可以防治食物中毒和腸道疾病，并發(fā)現(xiàn)常吃納豆有助消化、預(yù)防疾病、延緩衰老、提高肝解毒能力、防治高血壓、解除病痛等好處，最重要的是納豆在溶解血栓方面具有巨大潛力。

培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵因素之一。在《發(fā)酵工藝原理和技術(shù)》中記載葡萄糖和蔗糖等被分解利用的速度快，它們是速效碳源。乳糖、淀粉被利用的速度相對較為緩慢，它們是遲效碳源。甘油能在溶解氧的參與作用下，被氧化成co2和h2o，釋放出比糖類更多的能量。現(xiàn)有的納豆菌發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗研究中，采用4種不同的碳源：可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及4種不同的氮源：大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨對納豆菌進(jìn)行了培養(yǎng)，納豆菌以大豆蛋白胨和葡萄糖為最佳碳氮源在35℃時發(fā)酵最好。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明對目前培養(yǎng)效果較好的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，選擇更為高效的常見碳源和氮源作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源和氮源的替代物，添加常見的水果蔬菜汁作為納豆菌的生長因子，采用單因素試驗篩選出最適宜濃度的碳源、氮源、生長因子，利用正交試驗進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最終選出最適合納豆菌生長、增菌效果最好的培養(yǎng)基。本發(fā)明采用新鮮水果蔬菜汁作為納豆菌的生長因子，較傳統(tǒng)的只添加某種單一維生素作為微生物的生長因子的方法來說營養(yǎng)更為豐富，而且有利于果蔬深加工生產(chǎn)中的廢料利用。

技術(shù)方案：

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種納豆菌培養(yǎng)基成分由如下組成：碳源、氮源、生長因子、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4。

進(jìn)一步地，所述碳源為2％-4％蔗糖、2％-4％麥芽糖、2％-4％甘油中的一種。

進(jìn)一步地，所述氮源為1％-3％(nh4)2so4、1％-3％酵母浸粉、1％-3％酸水解酪蛋白、1％-3％nh4cl中的一種。

進(jìn)一步地，所述生長因子為5％-15％胡蘿卜汁、5％-15％西紅柿汁、5％-15％菠蘿皮汁中的一種。

進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基成分為：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠蘿皮汁、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4。

進(jìn)一步地，所述胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的制作方法為：分別取200g鮮胡蘿卜、鮮西紅柿、鮮菠蘿皮，切碎后加入等量的水，打漿并煮沸20min后，進(jìn)行冷卻、過濾，取濾液并定容到200ml。

本發(fā)明納豆培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，包括如下步驟：

1)制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基：采用葡萄糖3％、蛋白胨2％、mgso40.2％、k2hpo40.1％、kh2po40.2％作為活化和傳代培養(yǎng)基；

2)制備納豆菌的液體種子培養(yǎng)基：在錐形瓶中裝入150ml上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滅菌后取納豆菌0.3g接種于錐形瓶中，在40℃、150r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后進(jìn)行3次傳代培養(yǎng)；

3)納豆菌生長培養(yǎng)：將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納豆菌置于40℃、150r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h；

4)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化：分別采用2％蔗糖、3％蔗糖、4％蔗糖、2％麥芽糖、3％麥芽糖、4％麥芽糖、2％乳糖、3％乳糖、4％乳糖、2％甘油、3％甘油、4％甘油替代上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分及含量不變，對納豆菌的生長進(jìn)行培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果；

5)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化：分別采用1％(nh4)2so4、2％(nh4)2so4、3％(nh4)2so4、1％酵母浸粉、2％酵母浸粉、3％酵母浸粉、1％酸水解酪蛋白、2％酸水解酪蛋白、3％酸水解酪蛋白、1％nh4cl、2％nh4cl、3％nh4cl替代上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分及含量不變，對納豆菌的生長進(jìn)行培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果；

6)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長因子的優(yōu)化：將果蔬汁作為生長因子添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加10％胡蘿卜汁、10％西紅柿汁、10％菠蘿皮汁、5％胡蘿卜汁、5％西紅柿汁、5％菠蘿皮汁、15％胡蘿卜汁、15％西紅柿汁、15％菠蘿皮汁，基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分及含量不變，對納豆菌的生長進(jìn)行培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果；

7)分別將上述優(yōu)化培養(yǎng)基測量培養(yǎng)基的od600nm值，篩選出納豆菌增菌效果較好的三種碳源，通過對單因素試驗的結(jié)果進(jìn)行分析并利用正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

8)將上述正交試驗做出的最優(yōu)方案、理論上的最優(yōu)方案及基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重新培養(yǎng)，測定它們的od600nm值進(jìn)行比較，并采用稀釋平板計數(shù)法在40℃下分別培養(yǎng)24h后進(jìn)行計數(shù)，以最終的菌落數(shù)作為最主要的指標(biāo)得到培養(yǎng)基的最佳配方。

進(jìn)一步地，所述步驟4)、5)、6)中的納豆菌的生長培養(yǎng)條件為：在無菌條件下將液體種子培養(yǎng)基接種到各個優(yōu)化培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)ph值為7.2，分裝高壓滅菌，冷卻，在無菌操作臺中進(jìn)行接種，接種量為5％，在40℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h、17h、20h。

進(jìn)一步地，所述步驟8)中的重新培養(yǎng)條件為：分別在三種培養(yǎng)基中接種5％的納豆菌，在40℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17h。

進(jìn)一步地，所述步驟7)、8)中培養(yǎng)基的od600nm值的測定方法為：培養(yǎng)完成后利用未接種的培養(yǎng)基作為空白樣，經(jīng)紫外分光光度計測定并進(jìn)行比較。

附圖說明

圖1納豆菌的生長曲線圖

圖2不同比例的蔗糖作為碳源納豆菌的od600nm值曲線

圖3不同比例的麥芽糖作為碳源納豆菌的od600nm值曲線

圖4不同比例的乳糖作為碳源納豆菌的od600nm值曲線圖

圖5不同比例的甘油作為碳源納豆菌的od600nm值曲線

圖6不同比例的硫酸銨作為氮源納豆菌的od600nm值曲線

圖7不同比例的氯化銨作為氮源納豆菌的od600nm值曲線

圖8不同比例的酵母浸粉作為氮源納豆菌的od600nm值曲線圖

圖9不同比例的酸水解酪蛋白作為氮源納豆菌的od600nm值曲線圖

圖1010％胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為生長因子納豆菌的od600nm值曲線圖

圖115％胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為生長因子納豆菌的od600nm值曲線圖

圖1215％胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為生長因子納豆菌的od600nm值曲線圖

具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干變型和改進(jìn)，這些也應(yīng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1

1、納豆菌培養(yǎng)基優(yōu)化過程研究

1.1材料與試劑

納豆菌由北京川秀科技有限公司提供；胡蘿卜、西紅柿、菠蘿于市場上購買。

1.2儀器與設(shè)備

jyl-350a九陽料理機(jī)九陽股份有限公司；bcm-1000生物潔凈工作臺蘇州蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ldzh-100kbs立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；i2可見分光光度計濟(jì)南海能儀器股份有限公司；fe20實驗室ph計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；vortex-be1渦旋振蕩器海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3方法與結(jié)果

1.3.1納豆菌的生長曲線

將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納豆菌置于40℃、150r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h，每2h對納豆菌的生物量進(jìn)行一次測定，繪制納豆菌的生長曲線，具體見附圖1。

通過圖表可以看出，在16h時納豆菌的生長達(dá)到最大值，但在14～20h范圍內(nèi)差別不大，故可以將納豆菌的最大生物量區(qū)間縮小到14～20h范圍內(nèi)，因此需要對這個區(qū)間的生長情況進(jìn)行進(jìn)一步的測定觀察。16h和18h時的od600nm值較為相近，17h也有可能是最大值點，選取14h、17h、20h作為單因素試驗的三個主要測定時間點。

1.3.2碳源、氮源和生長因子單因素試驗

1.3.2.1碳源的篩選結(jié)果

本試驗選取了4種可能較好的碳源，即蔗糖、麥芽糖、乳糖和甘油，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化中所述的方法，通過試驗對14h、17h、20h的納豆菌生物量進(jìn)行測定，結(jié)果分別見附圖2-5。

由圖2，蔗糖濃度為2％時，納豆菌的od600nm值在17h時達(dá)到最大的0.607。從14h的0.591到17h階段增長較平緩，并在17h之后出現(xiàn)明顯的下降。說明17h時納豆菌的最大生物量點，之后進(jìn)入衰亡期。蔗糖濃度為3％時，納豆菌的od600nm值從14h的0.624到17h的0.635再到20h的0.618并沒有明顯的上升或者下降，此時納豆菌的穩(wěn)定期較2％的蔗糖作為碳源時有所延長。蔗糖濃度為4％時，14h到17h的增長較小并在17h后出現(xiàn)明顯下降。綜上所述，納豆菌在17h的od600nm值為0.701，是三種不同濃度的蔗糖作為碳源時的最大生物量。

由圖3，麥芽糖濃度為2％時，納豆菌在14～17h之間生長迅速并在17h時od600nm值達(dá)到最大值0.659，而后出現(xiàn)下降進(jìn)入衰亡期。麥芽糖濃度為3％時，od600nm值從14h～17h就出現(xiàn)了0.003的少量下降，在17～20h之間又下降了0.019，根據(jù)納豆菌的生長曲線可以判斷出在這種情況下，納豆菌的最大生物量點出現(xiàn)在稍早于14h并且最大生物量不會超過2％的麥芽糖作為納豆菌培養(yǎng)基的碳源時17h的od600nm值0.659。當(dāng)麥芽糖濃度為4％時，納豆菌也已經(jīng)逐漸進(jìn)入衰亡期。同樣可以根據(jù)14～17h的od600nm值下降量0.012和17～20h的下降量0.025進(jìn)行推斷，此時納豆菌的最大生物量點出現(xiàn)在稍早于14h并且最大生物量也不會超過2％的麥芽糖作為納豆菌培養(yǎng)基的碳源時17h的od600nm值0.659。

如圖4，當(dāng)乳糖濃度為2％時，納豆菌在20h的od600nm值達(dá)到最大的0.842，雖然最大值點有所推遲，但由于其在14h、17h、20h三點的od600nm值差別不大，故也可視為17h為最大值點。當(dāng)乳糖濃度為3％時，納豆菌在14～20h區(qū)間內(nèi)的生長趨勢較為平穩(wěn)并在17h時達(dá)到最大的生物量，od600nm值為0.831。乳糖濃度為4％時，根據(jù)納豆菌的od600nm值曲線可以看出納豆菌在14h時就已經(jīng)逐漸進(jìn)入衰退期了，14～17h納豆菌的od600nm值下降了0.003，17～20h納豆菌的od600nm值下降了0.009，納豆菌的下降趨勢越來越明顯，故可以根據(jù)納豆菌的生長曲線圖分析出當(dāng)14h時，納豆菌od600nm值剛剛開始下降，證明在14h附近納豆菌已經(jīng)達(dá)到最大生物量，且最大生物量應(yīng)該0.810左右，并且不會超過當(dāng)2％的乳糖作為納豆菌培養(yǎng)基的碳源時17h的od600nm值0.839。

如圖5，當(dāng)碳源為甘油時，甘油含量為2％、3％、4％的納豆菌都是在17h生長情況最好，并在17～20h之間生長較為穩(wěn)定。此區(qū)間內(nèi)納豆菌的生物量并沒有太顯著的差異。其中3％的甘油增菌效果最好。但與其他不同的碳源相比，增菌效果不明顯。

通過以上不同的碳源之間的比較可以看出，碳源的濃度并不是越高越好，有時過高的碳源濃度反而會對納豆菌的生長起到抑制作用。通過比較od600nm值的大小后選擇較好的三種碳源為：2％乳糖、3％乳糖、4％蔗糖。

1.3.2.2氮源的篩選結(jié)果

本次試驗通過選取4種較好的氮源，(nh4)2so4、nh4cl、酵母浸粉、酸水解酪蛋白，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化中所述的方法，通過試驗對14h、17h、20h的納豆菌生物量進(jìn)行測定，結(jié)果分別見附圖6-9。

由圖6可知，(nh4)2so4占1％時，納豆菌在14～17h內(nèi)迅速大量生長并在17h達(dá)到最大生物量od600nm值為0.142。(nh4)2so4濃度為2％時，納豆菌的生長雖然較為緩慢但也在17h達(dá)到最大生物量od600nm值為0.119。當(dāng)3％的(nh4)2so4作為氮源時，納豆菌的生長最為緩慢，17h達(dá)到的最大生物量od600nm值僅為0.114。

由圖7可知當(dāng)nh4cl作為氮源時，三種不同濃度的氮源都使納豆菌在14h或者在其之前就達(dá)到最大生物量。通過比較這3種氮源培養(yǎng)的納豆菌的生長量可以看出，當(dāng)3％的nh4cl作為納豆菌的氮源時，納豆菌的生長情況最好。

由圖8時，當(dāng)酵母浸粉作為唯一氮源時，三種不同濃度的氮源使得納豆菌在14h出現(xiàn)較大值。通過數(shù)據(jù)分析其菌數(shù)增長趨勢，3％的酵母浸粉作為氮源時菌數(shù)最大值不會超過0.9，由于生物量之間的差別不大，在17h時菌數(shù)沒有出現(xiàn)明顯的下降，可以近似的認(rèn)為其為最大生物量點。酵母浸粉的比例為2％和3％時，納豆菌的生物量都比較大。

由圖9可知，將1％的酸水解酪蛋白作為唯一氮源時，17h納豆菌出現(xiàn)最大生物量0.726，隨后逐漸進(jìn)入衰亡期。2％的酸水解酪蛋白作為唯一氮源時，納豆菌的生長速度有了較大提升，在14h時生物量為0.600隨后繼續(xù)迅速增長并在17h達(dá)到最大生長量0.788，但之后又快速下降。這種氮源雖然提高了納豆菌的增長速度但也縮短了納豆菌的穩(wěn)定期。酸水解酪蛋白的濃度為3％時，在17h達(dá)到最大生物量od600nm值為0.754。

通過以上氮源的比較，依據(jù)od600nm值評價出最好的三種氮源及其比例為：3％酵母浸粉、2％酸水解酪蛋白和2％酵母浸粉。

1.3.2.3生長因子的篩選結(jié)果

參考乳酸菌的新型培養(yǎng)基配方，利用胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為納豆菌的生長因子，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長因子的優(yōu)化中所述的方法，用5％、10％、15％三種不同的添加量進(jìn)行添加，各種生長因子及其不同濃度對納豆菌od600nm值的影響見附圖10-12。

由圖10可知，采用10％胡蘿卜汁作為納豆菌的生長因子時，納豆菌的長勢良好并在17h達(dá)到0.734，隨后仍然在快速增加并在20h達(dá)到最大值，之后的生長趨勢無法預(yù)測。同濃度的西紅柿汁作為納豆菌的生長因子時出現(xiàn)了幾乎相同的生長趨勢，同樣沒有在觀察測定的預(yù)測時間內(nèi)出現(xiàn)最大生長量。但考慮到本試驗選取的不同的氮源和碳源都能夠在17h使得納豆菌達(dá)到最大生長量，而且發(fā)酵時間較短能夠節(jié)約成本，故選用10％胡蘿卜汁作為生長因子培養(yǎng)納豆菌17h的od600nm值0.749作為這種濃度下的最大生長量，選用17h的od600nm值0.734作為10％西紅柿汁作為生長因子培養(yǎng)納豆菌的最大生長量。同濃度的菠蘿皮汁作為納豆菌的生長因子時，納豆菌在14～17h和17～20h的生長量為0.256和0.069，生長速度明顯放緩，可以預(yù)測其最終的最大生長量會超過1，為了統(tǒng)一培養(yǎng)時間，也視17h為納豆菌的最大生長量點。

由圖11可知，控制胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的添加量都為5％時，可以看到納豆菌的生長規(guī)律基本相同，都在17h出現(xiàn)最大生長量，并在17～20h增長速度接近于0。其中以5％菠蘿皮汁作為納豆菌的生長因子時生長情況最好。

如圖12，控制胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的添加量都為15％時，納豆菌在14～17h快速增加，并在17h達(dá)到最大生長量，并進(jìn)入穩(wěn)定期，這三種不同的生長因子都使得納豆菌的生長有較長的穩(wěn)定期。

對以上的各種不同的生長因子進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同的果蔬汁中含有的不同維生素及含量對納豆菌的作用也不相同，納豆菌對這些物質(zhì)的利用程度不同導(dǎo)致了納豆菌的生長情況也不盡相同，使得納豆菌的各個時期出現(xiàn)的時間長短和持續(xù)的時間都有所不同，本試驗中在17h基本都達(dá)到了最大生物量，選取17h作為最大生長量點，此時，最好的三種生長因子為10％胡蘿卜汁、10％菠蘿皮汁、5％菠蘿皮汁。

1.3.3增菌培養(yǎng)基正交實驗結(jié)果

依據(jù)正交試驗設(shè)計，在選定的最大生物量點17h，對各組試驗結(jié)果進(jìn)行測定和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如下：

表1正交試驗結(jié)果一覽表

根據(jù)極差分析的結(jié)果可以看出，碳源、氮源、生長因子對納豆菌的影響為碳源＞生長因子＞氮源，在4號試樣在17h時od600nm值最大，即a2c2b1組合?？樟衐的極差最小，說明碳源、氮源、生長因子之間不存在協(xié)同作用。但是根據(jù)正交試驗的分析，理論最佳組合應(yīng)該為a2c1b1，為了找出納豆菌在17h的最佳培養(yǎng)基配方，采用驗證試驗進(jìn)行驗證，并與基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行比較。

1.3.4驗證試驗

用正交試驗中的最佳組合a2c2b1和理論最佳組合a2c1b1及基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重新培養(yǎng)進(jìn)行驗證。結(jié)果如下表：

表2驗證試驗結(jié)果

由表2可知：經(jīng)顯著性分析，所選出的最佳培養(yǎng)基組合a2c2b1與理論最佳培養(yǎng)基組合a2c1b1及基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較,在5％水平上差異顯著。即最佳培養(yǎng)基為a2c2b1，即4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠蘿皮汁、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4配制成的培養(yǎng)基增菌效果最佳。優(yōu)化后的培養(yǎng)基使得納豆菌的生物量在17h較優(yōu)化前提高了0.607，納豆菌的菌落總數(shù)達(dá)到了2.8×109cfu/ml，比優(yōu)化前提高了一個數(shù)量級。

制備例1

一種納豆培養(yǎng)基成分為：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠蘿皮汁、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4。

培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，包括如下步驟：

1)制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基：采用葡萄糖3％、蛋白胨2％、mgso40.2％、k2hpo40.1％、kh2po40.2％作為活化和傳代培養(yǎng)基；

2)制備納豆菌的液體種子培養(yǎng)基：在錐形瓶中裝入150ml上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滅菌后取納豆菌0.3g接種于錐形瓶中，在40℃、150r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后進(jìn)行3次傳代培養(yǎng)；

3)納豆菌生長培養(yǎng)：將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納豆菌置于40℃、150r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h；

4)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化：分別采用2％蔗糖、3％蔗糖、4％蔗糖、2％麥芽糖、3％麥芽糖、4％麥芽糖、2％乳糖、3％乳糖、4％乳糖、2％甘油、3％甘油、4％甘油替代上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分及含量不變，對納豆菌的生長進(jìn)行培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果；

5)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化：分別采用1％(nh4)2so4、2％(nh4)2so4、3％(nh4)2so4、1％酵母浸粉、2％酵母浸粉、3％酵母浸粉、1％酸水解酪蛋白、2％酸水解酪蛋白、3％酸水解酪蛋白、1％nh4cl、2％nh4cl、3％nh4cl替代上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分及含量不變，對納豆菌的生長進(jìn)行培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果；

6)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長因子的優(yōu)化：將果蔬汁作為生長因子添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，胡蘿卜汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的制作方法為：分別取200g鮮胡蘿卜、鮮西紅柿、鮮菠蘿皮，切碎后加入等量的水，打漿并煮沸20min后，進(jìn)行冷卻、過濾，取濾液并定容到200ml；分別添加10％胡蘿卜汁、10％西紅柿汁、10％菠蘿皮汁、5％胡蘿卜汁、5％西紅柿汁、5％菠蘿皮汁、15％胡蘿卜汁、15％西紅柿汁、15％菠蘿皮汁，基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分及含量不變，對納豆菌的生長進(jìn)行培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果；

步驟4)、5)、6)中的納豆菌的生長培養(yǎng)條件為：在無菌條件下將液體種子培養(yǎng)基接種到各個優(yōu)化培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)ph值為7.2，分裝高壓滅菌，冷卻，在無菌操作臺中進(jìn)行接種，接種量為5％，在40℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h、17h、20h。

7)分別將上述優(yōu)化培養(yǎng)基測量培養(yǎng)基的od600nm值，篩選出納豆菌增菌效果較好的三種碳源，通過對單因素試驗的結(jié)果進(jìn)行分析并利用正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

8)將上述正交試驗做出的最優(yōu)方案、理論上的最優(yōu)方案及基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重新培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：分別在三種培養(yǎng)基中接種5％的納豆菌，在40℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17h；培養(yǎng)完成后利用未接種的培養(yǎng)基作為空白樣，經(jīng)紫外分光光度計測定它們的od600nm值進(jìn)行比較，并采用稀釋平板計數(shù)法在40℃下分別培養(yǎng)24h后進(jìn)行計數(shù)，以最終的菌落數(shù)作為最主要的指標(biāo)得到培養(yǎng)基的最佳配方。