與小麥抗穗發(fā)芽性狀相關(guān)的KASP分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及作物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及與小麥抗穗發(fā)芽性狀相關(guān)的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)鞘澜绲谌蠹Z食作物，僅次于水稻和玉米，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。小麥穗發(fā)芽(pre-harvestsprouting,phs)是指小麥在收獲前遇到的連綿陰雨時(shí)，未及收獲便在穗上發(fā)芽的一種現(xiàn)象。穗發(fā)芽是一種世界性的災(zāi)害，據(jù)報(bào)告，世界主要小麥栽培國如加拿在、日本、澳大利亞、中國均有嚴(yán)重穗發(fā)芽危害。我國有10大小麥主產(chǎn)區(qū)，主要以中國中部、東南部麥區(qū)如長江中下游麥區(qū)、西南麥區(qū)穗發(fā)芽危害更為嚴(yán)重，隨著近年來降雨北移現(xiàn)象，我國北部穗發(fā)芽麥區(qū)如北部冬麥區(qū)也常有穗發(fā)芽現(xiàn)象發(fā)生。

小麥籽粒在收獲前的穗發(fā)芽不僅會帶來大面積的糧食產(chǎn)量降低，也會導(dǎo)致小麥籽粒中水解等相關(guān)的酶活性迅速升高，降低籽粒中儲藏物質(zhì)含量，容重(testingweight)、出粉率和面粉降落值(fallingnumber)下降，造成小麥各種加工食品品質(zhì)惡化，且會影響小麥籽粒的儲存。因此，選育具有穗發(fā)芽抗性的小麥資源對小麥育種具有重大的實(shí)際意義。

分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)，是利用與目的性狀候選基因連鎖的分子標(biāo)記，通過分子生物學(xué)檢測候選基因分型，達(dá)到對目的性狀選擇的目的；其優(yōu)點(diǎn)是簡單快速，不受環(huán)境及環(huán)境互作的影響，能夠快速且高效的選育出目標(biāo)資源材料。單核苷酸的多態(tài)性(snp,singlenucleotidepolymorphisms),是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性，包括轉(zhuǎn)換(transition)、顛換(transversion)、缺失(deletion)和插入(insertion)。snp成為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與snp有關(guān)。主要有以下特點(diǎn)：1、數(shù)量多，分布廣泛；2、適于快速、規(guī)模化篩查；3、等位基因頻率的容易估計(jì)；4、易于基因分型。利用全基因組的snp關(guān)聯(lián)分析方法和候選基因的snp方差分析的方法，可以找到與表型相關(guān)的snp變異。

kasp(競爭性等位基因特異性pcr,即kompetitiveallele-specificpcr)技術(shù)是lgcgenomics公司的snpline基因分型檢測方案。該方案的核心是kasp技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)是基于引物末端堿基的特異匹配來對snp分型以及檢測indels(insertionsanddeletions，插入和缺失)。該項(xiàng)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是：其一，只要合成兩個(gè)通用熒光探針，兩個(gè)通用淬滅探針，再加合成多個(gè)針對具體位點(diǎn)的snppcr引物，就可以測許多位點(diǎn)；其二，因?yàn)闊晒馓结?、和淬滅探針都很貴，kasp方法相比于taqman方法，可以通過通用熒光探針來代替針對位點(diǎn)的熒光探針，大大節(jié)約成本。

因此，篩選出與抗穗發(fā)芽相關(guān)的snp，并將其開發(fā)為能準(zhǔn)確鑒定其snp位點(diǎn)的kasp標(biāo)記，對抗穗發(fā)芽材料選擇，在選育小麥抗穗發(fā)芽材料，減小穗發(fā)芽對小麥的影響，提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)等方面均有重要的意義。

中國小麥分布地域遼闊，由于各地自然條件、種植制度、品種類型和生產(chǎn)水平存在著不同程度的差異，一方面形成了明顯的種植區(qū)域，另一方面極大地豐富了中國地方品種的多樣性。利用大規(guī)模來自全國各地的地方品種，對其在2012年到2015年不同環(huán)境的穗發(fā)芽表型鑒定，并進(jìn)行全基因組的關(guān)聯(lián)分析，鑒定到3個(gè)位于小麥第3同源群的與穗發(fā)芽表型相關(guān)的snp標(biāo)記。針對這3個(gè)分子標(biāo)記展開進(jìn)一步研究，并將此開發(fā)為可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種的kasp標(biāo)記，能有效提高小麥育種效率和準(zhǔn)確性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供與小麥抗穗發(fā)芽性狀相關(guān)的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供與小麥抗穗發(fā)芽性狀相關(guān)的kasp分子標(biāo)記，共包含3個(gè)分子標(biāo)記，①分子標(biāo)記ax-111578083與抗穗發(fā)芽基因myb10-a1之間的遺傳圖距為0.35mb；②分子標(biāo)記ax-111624595與抗穗發(fā)芽區(qū)段r-loci之間的遺傳圖距為3.55mb；③分子標(biāo)記ax-110772653與抗穗發(fā)芽區(qū)段r-loci之間的遺傳圖距為3.73mb。分子標(biāo)記ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653均來自中國地方品種小麥，分別位于中國春survey序列(iwgsc2.28)3a染色體173.81mb、3d染色體112.63mb和112.80mb，它們的核苷酸序列分別如seqidno:1-3所示。

本發(fā)明還提供基于kasp技術(shù)開發(fā)的用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的引物，包括正向引物al1、正向引物al2和反向引物c。

其中，擴(kuò)增分子標(biāo)記ax-111578083的引物序列分別如seqidno:4-6所示，擴(kuò)增分子標(biāo)記ax-111624595的引物序列分別如seqidno:7-9所示，擴(kuò)增分子標(biāo)記ax-110772653的引物序列分別如seqidno:10-12所示。

本發(fā)明還提供含有所述引物的用于鑒定與小麥抗穗發(fā)芽性狀相關(guān)的kasp分子標(biāo)記的檢測試劑盒。

本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記、引物或試劑盒在小麥抗穗發(fā)芽材料創(chuàng)制中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記、引物或試劑盒在分子標(biāo)記輔助小麥抗穗發(fā)芽選擇育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述分子標(biāo)記、引物或試劑盒在選育具有穗發(fā)芽抗性的小麥資源中的應(yīng)用。包括以下步驟：

1)提取待測小麥樣品的dna；

2)取濃度為50-100ng/μl的模板dna1.00μl，引物混合液0.14μl，kaspmastermix5.00μl，50mm的mgcl2溶液0.08μl，h2o3.78μl，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；引物混合液中正向引物al1和正向引物al2的終濃度均為10μm，反向引物c的終濃度為10μm；

3)采用熒光檢測儀分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物基因型。

步驟2)pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；第一步擴(kuò)增反應(yīng)：95℃變性20秒，68℃梯度退火并延伸60秒，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火及延伸的溫度降低1℃；第二步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，30個(gè)循環(huán)；12℃保存。

步驟3)具體為：利用生物學(xué)軟件對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型：等位位點(diǎn)ax-111578083-g為攜有抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位類型植株，等位位點(diǎn)ax-111624595-c為攜有抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位類型植株，等位位點(diǎn)ax-110772653-t為攜有抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位類型植株。

鑒定小麥抗穗發(fā)芽的引物以及檢測小麥抗穗發(fā)芽能力強(qiáng)弱的方法在如下(a)-(e)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(a)篩選抗穗發(fā)芽能力強(qiáng)的小麥品種。

(b)篩選抗穗發(fā)芽能力弱的小麥品種。

(c)培育抗穗發(fā)芽的小麥新品種。

(d)所述3個(gè)kasp分子標(biāo)記在小麥特異抗穗發(fā)芽材料創(chuàng)制中的應(yīng)用。

(e)所述3個(gè)kasp分子標(biāo)記引物在小麥特異抗穗發(fā)芽材料創(chuàng)制中的應(yīng)用。

本發(fā)明小麥抗穗發(fā)芽候選位點(diǎn)及其分子標(biāo)記是通過以下方法獲得的：

(1)通過收集來自中國10大麥區(qū)的272份地方品種小麥組成自然群體。

(2)自然群體穗發(fā)芽多年多點(diǎn)鑒定

于2012年-2015年在溫江、雅安、崇州共6個(gè)不同的環(huán)境下，于蠟熟期收獲小麥籽粒，將其懸掛于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干7d后，進(jìn)行人工脫粒。在有蓋塑料培養(yǎng)皿中墊上用3-5ml蒸餾水潤濕的濾紙進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。每隔一天挑出已露白和已發(fā)霉的種子，并分別計(jì)數(shù)，種子發(fā)芽率以第7天發(fā)芽種子數(shù)占總種子數(shù)百分比表示，計(jì)算發(fā)芽率。

發(fā)芽率(％)＝發(fā)芽種子數(shù)/(種子總數(shù)-發(fā)霉數(shù))×100％

(3)基因型掃描

a)基因組dna提取:采用ctab法提取272自然群體群體植株dna，檢測其濃度，并稀釋至50-100ng/ul。

b)wheat660snp掃描

①所有材料送至博奧公司affymetrix平臺，并進(jìn)行g(shù)enomicdna質(zhì)量檢測，用wheat660snparray進(jìn)行全基因組掃描。

②wheat660snparray原始數(shù)據(jù)分析：以上述步驟共獲得630517個(gè)snp探針，通過目前發(fā)表的小麥參考基因組圖譜iwgsc2.28，錨定到單一位點(diǎn)的共312,831個(gè)snp標(biāo)記，其中a基因組標(biāo)記122,338個(gè)，b基因組標(biāo)記137,494個(gè)，d基因組標(biāo)記52,999個(gè)。

③自然群體標(biāo)記質(zhì)量控制：通過篩選在272份中國地方品種中有差異、缺失率小于20％且最小等位基因頻率(maf)大于5％標(biāo)記共178,803個(gè)。

④自然群體分層計(jì)算：所選178,803個(gè)高質(zhì)量snp分子標(biāo)記，利用生物信息學(xué)軟件structure2.34評估地方品種群體分層，選擇最佳群體結(jié)果k＝5，獲得q值。

⑤自然群體親緣關(guān)系評估：所選178,803個(gè)高質(zhì)量snp分子標(biāo)記，利用生物信息學(xué)軟件kinship評估地方品種群親緣關(guān)系，獲得k值。

⑥穗發(fā)芽全基因組關(guān)聯(lián)分析：所選178,803個(gè)高質(zhì)量snp分子標(biāo)記，以及前面得到的q和k值，加上6個(gè)不同環(huán)境下的穗發(fā)芽表型，利用生物信息學(xué)軟件tassel5.0進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(gwas)，鑒定到3個(gè)穩(wěn)定與穗發(fā)芽表型強(qiáng)選擇相關(guān)的分子標(biāo)記ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653。

(4)kasp標(biāo)記的開發(fā)

為了方便對小麥抗穗發(fā)芽候選材料進(jìn)行3個(gè)snp標(biāo)記ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653的鑒定和輔助選擇，同時(shí)為了降低育種成本和工作量，增強(qiáng)育種工作中的可操作性，需要將與目標(biāo)分子標(biāo)記探針序列開發(fā)為基于常規(guī)分子生物學(xué)手段可用于鑒定和篩選的kasp標(biāo)記，以下是相關(guān)kasp標(biāo)記開發(fā)過程中的主要步驟：

①探針序列：

為開發(fā)基于實(shí)驗(yàn)室可用pcr技術(shù)的分子標(biāo)記，方便用于分子標(biāo)記輔助育種及應(yīng)用，本發(fā)明開展了將ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653探針序列轉(zhuǎn)化為常規(guī)分子標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)，已知的snp標(biāo)記ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653探針序列分別如下：

ax-111578083:

cgtcacatggagcatcaggatcggtagcttccccc[a/g]tgaggattggaccagggatcaccacataagatcca(seqidno:1)

ax-111624595:

tccaccgtagtgggaggcctatgaaccaacgaatt[c/t]gcggaggagccaacaaaaggagaccgcacgacagatctgcccgaagtgacacatgtctccacgactggcgtgta(seqidno:2)

ax-110772653:

gtggtgtggaactgcctcaaccgcgcctcttggag[a/t]tgtgcctcgctggacccgagttcttcccctcatct(seqidno:3)

②引物設(shè)計(jì):

根據(jù)已知的snp標(biāo)記ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653探針序列設(shè)計(jì)如下引物：

ax-111578083:

正向引物al1:5’–3’gaaggtgaccaagttcatgctgatcggtagcttccccca(seqidno:4)

正向引物al2:5’–3’gaaggtcggagtcaacggattgatcggtagcttcccccg(seqidno:5)

反向引物c:5’–3’gtgatccctggtccaatc(seqidno:6)

ax-111624595:

正向引物al1:5’–3’gaaggtgaccaagttcatgctggcctatgaaccaacgaattc(seqidno:7)

正向引物al2:5’–3’gaaggtcggagtcaacggattggcctatgaaccaacgaattt(seqidno:8)

反向引物c:5’–3’cagtcgtggagacatgtgtcac(seqidno:9)

ax-110772653:

正向引物al1:5’–3’gaaggtgaccaagttcatgctcaaccgcgcctcttggaga(seqidno:10)

正向引物al2:5’–3’gaaggtcggagtcaacggattcaaccgcgcctcttggagt(seqidno:11)

反向引物c:5’–3’cgagttcttcccctcatct(seqidno:12)

③引物檢測:

以22份中國地方品種小麥基因組dna為模板，分別利用以上引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，bio-radicyclerthermalcyclerw/iq5opticalmoduleforrt-pcr(bio-radiq5實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀)在37℃進(jìn)行熒光收集，利用生物信息學(xué)軟件bioradcfxmanager對pcr產(chǎn)物進(jìn)行分型。

本發(fā)明提供小麥分子育種領(lǐng)域3個(gè)用于篩選抗穗發(fā)芽基因的分子標(biāo)記(引物)及方法和應(yīng)用。分析表明，基于snp標(biāo)記及其側(cè)翼序列開發(fā)出的3個(gè)位于小麥第3同源群的kasp標(biāo)記(競爭性等位基因特異性pcr標(biāo)記)，能準(zhǔn)確地對抗穗發(fā)芽候選位點(diǎn)進(jìn)行分型，預(yù)測小麥的穗發(fā)芽抗性，從而更加方便地在實(shí)驗(yàn)室條件下對抗穗發(fā)芽材料進(jìn)行鑒定和篩選。利用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)能有效避免環(huán)境因素和人為誤差對表型鑒定帶來的影響。本發(fā)明的3個(gè)kasp分子標(biāo)記，能提供強(qiáng)選擇位點(diǎn)，提高抗穗發(fā)芽育種材料選擇的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)小麥抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記輔助選擇育種的目標(biāo)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中國地方品種小麥多年多點(diǎn)的表型與基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(關(guān)聯(lián)分析顯著位點(diǎn)ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653)，圖譜信息來自中國春survey序列iwgsc2.28。

圖2為本發(fā)明snp位點(diǎn)ax-111578083的kasp分子標(biāo)記在已知基因型的22份中國地方品種中的鑒定結(jié)果，其中等位位點(diǎn)ax-111578083-g為攜有抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位類型植株。

圖3為本發(fā)明snp位點(diǎn)ax-111624595的kasp分子標(biāo)記在已知基因型的22份中國地方品種中的鑒定結(jié)果，其中等位位點(diǎn)ax-111624595-c為攜有抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位類型植株。

圖4為本發(fā)明snp位點(diǎn)ax-110772653的kasp分子標(biāo)記在已知基因型的22份中國地方品種中的鑒定結(jié)果，其中等位位點(diǎn)ax-110772653-t為攜有抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位類型植株。

圖5為本發(fā)明3個(gè)不同snp位點(diǎn)的kasp標(biāo)記(ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653)在138份中國主推品種中的類型以及對應(yīng)的穗發(fā)芽表型對比結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1小麥中國地方品種抗穗發(fā)芽候選snp位點(diǎn)的定位及分子標(biāo)記的獲得

1、收集來自中國十大麥區(qū)的地方品種小麥，分別于2012年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安農(nóng)場，2013年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江實(shí)驗(yàn)基地和崇州現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)基地，2014年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江實(shí)驗(yàn)基地和2015年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)基地。

2、穗發(fā)芽鑒定

收獲小麥蠟熟期種子，將其懸掛于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干7d后，進(jìn)行人工脫粒。在有蓋塑料培養(yǎng)皿中鋪上用3-5ml蒸餾水潤濕的濾紙進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。每隔一天挑出已露白和已發(fā)霉的種子，并分別計(jì)數(shù)，種子發(fā)芽率以第7天發(fā)芽種子數(shù)占總種子數(shù)百分比表示，計(jì)算發(fā)芽率。

發(fā)芽率(％)＝發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)-發(fā)霉數(shù)×100％

3、基因型分析

a)基因組dna提?。翰捎胏tab法提取中國地方品種基因組總dna。檢測其濃度，并稀釋至50-100ng/ul。

b)wheat660snp掃描

①所有材料送至博奧公司affymetrix平臺，并進(jìn)行g(shù)enomicdna質(zhì)量檢測，用wheat660snparray進(jìn)行全基因組掃描。

②wheat660snparray原始數(shù)據(jù)分析：以上述步驟共獲得630517個(gè)snp探針，通過目前發(fā)表的小麥參考基因組圖譜iwgsc2.28，錨定到單一位點(diǎn)的共312,831個(gè)snp標(biāo)記，其中a基因組標(biāo)記122,338個(gè)，b基因組標(biāo)記137,494個(gè)，d基因組標(biāo)記52,999個(gè)。

③自然群體標(biāo)記質(zhì)量控制：通過篩選在272份中國地方品種中有差異、缺失率小于20％且最小等位基因頻率(maf)大于5％標(biāo)記共178,803個(gè)。

④自然群體分層計(jì)算：所選178,803個(gè)高質(zhì)量snp分子標(biāo)記，利用生物信息學(xué)軟件structure2.34評估地方品種群體分層，選擇最佳群體結(jié)果k＝5，獲得q值。

⑤自然群體親緣關(guān)系評估：所選178,803個(gè)高質(zhì)量snp分子標(biāo)記，利用生物信息學(xué)軟件kinship評估地方品種群親緣關(guān)系，獲得k值。

⑥穗發(fā)芽全基因組關(guān)聯(lián)分析：所選178,803個(gè)高質(zhì)量snp分子標(biāo)記，以及前面得到的q和k值，加上6個(gè)不同環(huán)境下的穗發(fā)芽表型，利用生物信息學(xué)軟件tassel5.0進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(gwas),鑒定到3個(gè)穩(wěn)定與穗發(fā)芽表型強(qiáng)選擇相關(guān)的分子標(biāo)記ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653(圖1)。分別對三個(gè)snp標(biāo)記的不同類型所對應(yīng)的發(fā)芽率進(jìn)行方差分析，鑒定到等位位點(diǎn)ax-111578083-g，ax-111624595-c，ax-110772653-t為抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位位點(diǎn)。

4、kasp標(biāo)記的開發(fā)

為了方便對小麥抗穗發(fā)芽候選材料進(jìn)行3個(gè)snp標(biāo)記ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653的鑒定和輔助選擇，同時(shí)為了降低育種成本和工作量，增強(qiáng)育種工作中的可操作性，需要將與目標(biāo)分子標(biāo)記探針序列開發(fā)為基于常規(guī)分子生物學(xué)手段可用于鑒定和篩選的kasp標(biāo)記。我們分別下載或延長每個(gè)snp標(biāo)記前后至少35bp堿基序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物(al1、al2)和一條共用反向引物c。

③引物檢測:

以22份中國地方品種小麥基因組dna為模板，利用seqidno:4-12所示的引物對模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

a.pcr擴(kuò)增體系如下所示:

引物混合液中正向引物al1和正向引物al2的終濃度均為10μm，反向引物c的終濃度為10μm。

b.pcr反應(yīng)程序如下所示:

c.pcr產(chǎn)物檢測使用bio-radicyclerthermalcyclerw/iq5opticalmoduleforrt-pcr(bio-radiq5實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀)在37℃進(jìn)行熒光收集，利用生物信息學(xué)軟件bioradcfxmanager對pcr產(chǎn)物進(jìn)行分型，并與已知基因型進(jìn)行對照。

實(shí)施例2本發(fā)明分子標(biāo)記在選擇抗穗發(fā)芽候選位點(diǎn)中的應(yīng)用

1、收集來自中國各麥區(qū)主推品種共138份，于2015-2016年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)基地，并在蠟熟期收種進(jìn)行發(fā)芽率鑒定。

2、對收獲的主推品種進(jìn)行kasp標(biāo)記檢測，具體方法為：于三葉期提取葉片基因組總dna；以138份主推品種和16份已知基因型地方品種(對照)的基因組dna為底物，用開發(fā)的kasp標(biāo)記引物分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所述引物為：

ax-111578083:

正向引物al1:5’–3’gaaggtgaccaagttcatgctgatcggtagcttccccca(seqidno:4)

正向引物al2:5’–3’gaaggtcggagtcaacggattgatcggtagcttcccccg(seqidno:5)

反向引物c:5’–3’gtgatccctggtccaatc(seqidno:6)

ax-111624595:

正向引物al1:5’–3’gaaggtgaccaagttcatgctggcctatgaaccaacgaattc(seqidno:7)

正向引物al2:5’–3’gaaggtcggagtcaacggattggcctatgaaccaacgaattt(seqidno:8)

反向引物c:5’–3’cagtcgtggagacatgtgtcac(seqidno:9)

ax-110772653:

正向引物al1:5’–3’gaaggtgaccaagttcatgctcaaccgcgcctcttggaga(seqidno:10)

正向引物al2:5’–3’gaaggtcggagtcaacggattcaaccgcgcctcttggagt(seqidno:11)

反向引物c:5’–3’cgagttcttcccctcatct(seqidno:12)

3、pcr產(chǎn)物檢測使用bio-radicyclerthermalcyclerw/iq5opticalmoduleforrt-pcr(bio-radiq5實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀)在37℃進(jìn)行熒光收集，利用生物信息學(xué)軟件bioradcfxmanager對pcr產(chǎn)物進(jìn)行分型，并與已知基因型進(jìn)行對照。

4、基因分型結(jié)果

①用ax-111578083引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，有129份主推品種擴(kuò)增出了等位位點(diǎn)al1(allelea)，僅有7份材料(5.15％)擴(kuò)增出了優(yōu)異等位位點(diǎn)al2(alleleg)，2份材料缺失。通過方差分析對比兩個(gè)等位位點(diǎn)的主推品種的發(fā)芽率在0.05水平上差異顯著(p值＝0.0135)，優(yōu)異等位al2(alleleg)所對應(yīng)主推品種平均發(fā)芽率為0.5350，等位位點(diǎn)al1(allelea)所對應(yīng)主推品種平均發(fā)芽率為0.7848(圖2)。

②用ax-111624595引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，有127份主推品種擴(kuò)增出了等位位點(diǎn)al2(allelet)，僅有9份材料(6.62％)擴(kuò)增出了優(yōu)異等位位點(diǎn)al1(allelec)，2份材料缺失。通過方差分析對比兩個(gè)等位位點(diǎn)的主推品種的發(fā)芽率在0.001水平上差異極顯著(p值＝1.1e-09)，優(yōu)異等位al1(allelec)所對應(yīng)主推品種平均發(fā)芽率為0.2986，等位位點(diǎn)al2(allelet)所對應(yīng)主推品種平均發(fā)芽率為0.8023(圖3)。

③用ax-110772653引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，有121份主推品種擴(kuò)增出了等位位點(diǎn)al1(allelea)，僅有15份材料(11.03％)擴(kuò)增出了優(yōu)異等位位點(diǎn)al2(allelet)，2份材料缺失。通過方差分析對比兩個(gè)等位位點(diǎn)的主推品種的發(fā)芽率在0.001水平上差異極顯著(p值＝5.3e-08)，優(yōu)異等位al2(allelet)所對應(yīng)主推品種平均發(fā)芽率為0.4518，等位位點(diǎn)al1(allelea)所對應(yīng)主推品種平均發(fā)芽率為0.8108(圖4)。

5、利用3個(gè)kasp標(biāo)記(ax-111578083、ax-111624595和ax-110772653)在138份中國主推品種中，對抗穗發(fā)芽候選位點(diǎn)進(jìn)行分型，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明：

①從中國地方品種里鑒定到的抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位位點(diǎn)，在中國主推品種里同樣適用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致。說明本發(fā)明的抗穗發(fā)芽候選標(biāo)記確實(shí)具有抗穗發(fā)芽的作用。

②從中國地方品種里鑒定到的抗穗發(fā)芽優(yōu)異等位位點(diǎn)，在中國主推品種里的頻率很低(5.15％-11.03％)。說明本發(fā)明的抗穗發(fā)芽候選位點(diǎn)標(biāo)記適應(yīng)用于中國主推栽培品種中。

③本發(fā)明的3個(gè)kasp分子標(biāo)記，序列、引物明確，染色體位置清晰，高效、準(zhǔn)確，經(jīng)案例實(shí)施，可直接用于分子標(biāo)記輔助選擇育種中。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>與小麥抗穗發(fā)芽性狀相關(guān)的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>khp171113057.6

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<213>n=a或g

<400>1

cgtcacatggagcatcaggatcggtagcttcccccntgaggattggaccagggatcacca60

cataagatcca71

<210>2

<211>110

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<213>n=c或t

<400>2

tccaccgtagtgggaggcctatgaaccaacgaattngcggaggagccaacaaaaggagac60

cgcacgacagatctgcccgaagtgacacatgtctccacgactggcgtgta110

<210>3

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<213>n=a或t

<400>3

gtggtgtggaactgcctcaaccgcgcctcttggagntgtgcctcgctggacccgagttct60

tcccctcatct71

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gaaggtgaccaagttcatgctgatcggtagcttccccca39

<210>5

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gaaggtcggagtcaacggattgatcggtagcttcccccg39

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gtgatccctggtccaatc18

<210>7

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gaaggtgaccaagttcatgctggcctatgaaccaacgaattc42

<210>8

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gaaggtcggagtcaacggattggcctatgaaccaacgaattt42

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cagtcgtggagacatgtgtcac22

<210>10

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gaaggtgaccaagttcatgctcaaccgcgcctcttggaga40

<210>11

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gaaggtcggagtcaacggattcaaccgcgcctcttggagt40

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cgagttcttcccctcatct19