本發(fā)明涉及一種分子信標(biāo)探針，具體涉及一種檢測(cè)泌尿生殖道病原體淋球菌的分子信標(biāo)探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
：引起泌尿生殖道炎癥最常見(jiàn)的病原體包括淋球菌、沙眼衣原體和解脲支原體。目前對(duì)淋球菌的診斷主要有直接鏡檢和細(xì)胞培養(yǎng)。直接鏡檢雖然速度快但準(zhǔn)確率較低，常用的細(xì)胞培養(yǎng)法準(zhǔn)確性雖然有所提高但時(shí)間消耗久，且檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜。因此提供一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單且靈敏度較高的泌尿生殖道病原體淋球菌檢測(cè)方法有著顯著的臨床意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)泌尿生殖道病原體淋球菌的分子信標(biāo)探針及試劑盒。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種檢測(cè)泌尿生殖道病原體淋球菌的分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列為：probegn：5'-ccctaccccataagtaggtagggtaaccgcaagggtaggg-3'，所述分子信標(biāo)探針的5'端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。優(yōu)選的，所述熒光基團(tuán)選自fam、fluorescein、joe、tet、hex、cyanine3、rox、texasred、cyanine5或cyanine5.5，所述淬滅基團(tuán)選自bhq-1、bhq-2、bhq-2或dabcyl。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包括上述分子信標(biāo)探針。優(yōu)選的，上述試劑盒還包括雜交液，每100ml所述雜交液包括以下組分：25ml的50*denhardtt's液，10ml的50*ssc，5ml的50*ssc，100ug/ml的變性鮭精dna，10g的硫酸葡聚糖。優(yōu)選的，使用上述所述分子信標(biāo)探針的濃度為5pmol/ul。本發(fā)明還提供了對(duì)泌尿生殖道病原體淋球菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法包括以下步驟：(1)按照淋球菌(n.gonorrhoeae)16srna基因序列設(shè)計(jì)熒光信標(biāo)探針，其中淋球菌(n.gonorrhoeae)16srna基因序列為：ttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggggataccataagtaggtagggtaaccgcaaggagcccgcttaccacggtatgcttcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaacctgcggctggatcacctcctttctagagagagaagggctttaggcattcacacttatcggtaaactgaaaagatgcgga所設(shè)計(jì)合成的分子信標(biāo)探針probegn的堿基序列為：5'-ccctaccccataagtaggtagggtaaccgcaagggtaggg-3'，其5'端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)；(2)以泌尿生殖系統(tǒng)分泌物為檢測(cè)樣本，涂片并用固定液固定；(3)用上述雜交液將所述分子信標(biāo)探針進(jìn)行稀釋，然后與檢測(cè)樣本進(jìn)行雜交；(4)在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。本發(fā)明檢測(cè)的原理為：具有獨(dú)特“發(fā)夾”空間結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針在未與靶序列結(jié)合時(shí)，分子信標(biāo)呈“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，有一環(huán)序列和一莖序列，其中環(huán)序列是與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列，而莖序列是與靶位點(diǎn)無(wú)關(guān)的互補(bǔ)序列；在探針的兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，當(dāng)探針處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)相鄰，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)，使得熒光基團(tuán)被猝滅，不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，而當(dāng)探針與靶位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開(kāi)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)熒光顯微鏡可以檢測(cè)到該熒光信號(hào)。本發(fā)明的分子信標(biāo)探針能夠泌尿生殖道病原體淋球菌，且檢測(cè)準(zhǔn)確度高，靈敏度高。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。按照淋球菌(n.gonorrhoeae)16srna基因序列設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針，該分子信標(biāo)探針堿基序列為：5'fam-ccctaccccataagtaggtagggtaaccgcaagggtaggg-bhq13'。其中5'端標(biāo)記的是fam，3'端標(biāo)記的是bhq1，熒光基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515nm。按照淋球菌(n.gonorrhoeae)16srna基因序列設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記寡核苷酸探針probegnc：5'-fam-cataagtaggtagggtaaccgcaa-3'。實(shí)施例1以培養(yǎng)的淋球菌(n.gonorrhoeae)作為檢測(cè)目標(biāo)。收集2例女性泌尿生殖系統(tǒng)分泌物為標(biāo)本，按照比例加入培養(yǎng)的淋球菌，比例分別為a.單純淋球菌、b.單純的女性泌尿生殖系標(biāo)本、c.按10000細(xì)菌/ml的比例加入淋球菌。將以上a、b、c三例樣本分別以1xpbs稀釋，5000rpm離心，收集沉淀物，加入10％福爾馬林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)250ul固定液固定5分鐘，以1xpbs500ul洗2次，最后3000rpm離心5分，棄掉上清，將經(jīng)熱變性的分子信標(biāo)探針以1xdna雜交液稀釋到5pmol/ul，加200ul使沉淀懸浮，42℃孵育15分鐘。滴加在載玻片，直接在熒光顯微鏡下觀察并照相，計(jì)算熒光顯色細(xì)菌。結(jié)果不加淋球菌的樣本無(wú)熒光染色即陰性，單純的淋球菌樣本全部細(xì)菌都有熒光染色即陽(yáng)性，按10000細(xì)菌/ml的比例加入淋球菌的樣本，可以觀察到部分細(xì)菌有熒光染色亦即陽(yáng)性。每100ml上述dna雜交液包括以下組分：25ml的50*denhardtt's液，10ml的50*ssc，5ml的50*ssc，100ug/ml的變性鮭精dna，10g的硫酸葡聚糖。實(shí)施例2利用分子信標(biāo)探針probegn進(jìn)行檢測(cè)：以已知的50例淋球菌感染者、50例健康人的尿道分泌物樣本作為檢測(cè)目標(biāo)。將樣本輕緩?fù)磕ㄔ跐崈糨d玻片上，充分晾干后，使用丙酮固定10分鐘，自然晾干。將經(jīng)熱變性的分子信標(biāo)探針以1xdna雜交液稀釋到5pmol/ul，加200ul使沉淀懸浮，42℃孵育15分鐘。滴加在載玻片，直接在熒光顯微鏡下進(jìn)行閱片。利用上述普通型熒光標(biāo)記寡核苷酸探針probegnc進(jìn)行檢測(cè)：以已知的50例淋球菌感染者、50例健康人的尿道分泌物樣本作為檢測(cè)目標(biāo)。將樣本輕緩?fù)磕ㄔ跐崈糨d玻片上，充分晾干后，使用丙酮固定10分鐘，自然晾干。接著加入75℃變性5分鐘5pmol/ul的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針probegnc探針(探針以雜交緩沖液(20mmol/ltris,0.9mmol/lnacl，20％formamide，0.1％sds,ph7.2)稀釋)，然后在50℃下孵育45～60分鐘；將玻片依次用洗液a(2xssc、50％甲酰胺)、洗液b(10mmpbsph8.0、0.1％nonidetp-40)各清洗2次。在熒光顯微鏡下進(jìn)行閱片。分子信標(biāo)和普通熒光標(biāo)記寡核苷酸探針實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)相同均為：在60倍油浸物鏡下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行多視野觀察并對(duì)每視野中發(fā)出熒光的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并累加，按如下判斷標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本陰性(-)：連續(xù)觀察100個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)有發(fā)出熒光的細(xì)胞；標(biāo)本陽(yáng)性(+)：連續(xù)觀察100個(gè)不同視野，發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)大于1個(gè)/100視野，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定。按上述判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：已知標(biāo)本(金標(biāo)準(zhǔn))分子信標(biāo)探針熒光寡核苷酸探針樣品數(shù)+++46++-4---47--+3注：上述列表中，已知標(biāo)本(金標(biāo)準(zhǔn))：已知50例健康人尿道分泌物樣本作為陰性金標(biāo)準(zhǔn)，已知50例淋球菌感染者尿道分泌物樣本作為陽(yáng)性金標(biāo)準(zhǔn)；“-”：表示陰性即未檢出有淋球菌感染；“+”：表示陽(yáng)性即檢出有淋球菌感染。以已知50例健康人、50例淋球菌感染者尿道分泌物樣本作為金標(biāo)準(zhǔn)，分子信標(biāo)的陽(yáng)性檢出率為(46+4)/(46+4)x100％＝100％，熒光標(biāo)記寡核苷酸探針的陽(yáng)性檢出率為46/(46+4)x100％＝92％；分子信標(biāo)的假陽(yáng)性檢出率為0/(47+3)x100％＝0％，熒光標(biāo)記寡核苷酸探針的假陽(yáng)性檢出率為3/(47+3)x100％＝6％。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，分子信標(biāo)探針優(yōu)于熒光寡核苷酸探針。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變形，這些改進(jìn)和變形也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12