本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)，尤其涉及一種地龍蛋白多肽酒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：地龍又名蚯蚓(earthworm)、地龍子、曲繕,系環(huán)節(jié)動(dòng)物。其味咸性寒,人肝、脾、腎經(jīng)。始載于《別錄》“療傷寒伏熱狂謬,大腹黃疽”。據(jù)《本草綱目》記載本品具有清熱、平肝、定驚、止喘、通絡(luò)之功效。臨床上常用地龍或其復(fù)方治療慢性氣管炎、支氣管炎、支氣管哮喘、消化性潰瘍、高血壓病、慢性前列腺炎、血尿、血管性頭痛、三叉神經(jīng)痛、癲癰、腮腺炎、濕疹、帶狀疙疹、燒燙傷等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明地龍具有清熱、鎮(zhèn)定、抗驚厥、平喘、降血壓之功效。地龍肽是地龍?bào)w內(nèi)小分子質(zhì)量多肽的總稱，種類繁多，生物學(xué)功能復(fù)雜多樣。人們已從地龍?bào)w內(nèi)提取了多種具有生物活性的肽類，如纖維蛋白溶酶、催產(chǎn)素相關(guān)肽、肌肉運(yùn)動(dòng)活性肽、抗菌肽等。研究發(fā)現(xiàn)地龍肽具有促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育、抗凝血溶血栓的雙重作用、降壓作用、免疫增強(qiáng)作用、抗腫瘤作用、抗肝纖維化及抗菌作用等。地龍本身藥用價(jià)值高，高蛋白、低脂肪，是一種潛在的動(dòng)物蛋白資源。但是目前對(duì)地龍的研究主要集中在地龍水提取物、醇提取物等方面，而對(duì)地龍豐富蛋白質(zhì)資源的研究卻報(bào)道尚少。因此利用現(xiàn)代食品生物技術(shù)對(duì)地龍蛋白進(jìn)行深度開發(fā)，制備出具有保健作用的功能食品，不僅可提高現(xiàn)有資源的利用率，為地龍的深度加工提供一條新的途徑；而且可增強(qiáng)地龍中藥產(chǎn)業(yè)科技含量和市場競爭力，對(duì)提高我國中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化綜合利用技術(shù)水平和發(fā)展保健食品工業(yè)具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種地龍蛋白多肽酒。本發(fā)明以地龍蛋白多肽為主要成分，配以車前子、通草、澤瀉、燈心草的中藥輔藥，制備得到具有增加排尿量、具有利尿活性的保健藥酒，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用，增強(qiáng)利尿活性，可長達(dá)7個(gè)小時(shí)，具有緩釋性特點(diǎn)，適應(yīng)于長期給藥，減少不良反應(yīng)。本發(fā)明的目的之二在于一種地龍蛋白多肽酒的制備方法，該制備方法操作簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)得到的地龍蛋白多肽酒效果顯著。本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：提供一種地龍蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：地龍蛋白多肽1.5-2.5份、車前子8-14份、通草8-14份、澤瀉5-8份、燈心草5-8份以及酒精濃度為10-15％的黃酒75-85份。進(jìn)一步地，地龍蛋白多肽酒由如下重量份的組分制備而成：地龍蛋白多肽2份、車前子13份、通草12份、澤瀉6份、燈心草8份以及酒精濃度為10-15％的黃酒80份。進(jìn)一步地，所述地龍蛋白多肽為分子量介于1500-2500da的地龍蛋白多肽，該地龍蛋白多肽由如下步驟制得：(1)浸提提?。喝⌒迈r的蚯蚓，在水中浸泡24h，使其吐出腸道中的泥土等異物；清洗干凈后，加入1.5倍體積的磷酸鹽緩沖溶液用組織搗碎機(jī)搗碎，攪拌，浸提15-30h，離心15min，取其上清液；(2)蛋白質(zhì)改性：步驟(1)得到的上清液，調(diào)ph值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波處理5分鐘得到改性蛋白溶液；(3)酶解：以改性蛋白溶液為底物，調(diào)ph值至6.3-6.5，按照底物質(zhì)量百分比為1.5-2％加入復(fù)合酶拌勻，然后在50-55℃下，微波處理5分鐘，得到酶解液；(4)分離純化的步驟：將酶解液降至室溫，取上清液，依次用0045和002型蜂房式濾器過濾除菌,而后用中空纖維超濾柱超濾，收集濾液冷凍干燥，即得地龍蛋白多肽。進(jìn)一步地，在步驟(1)中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.02mol/l、ph值為6.0；所述浸提條件為在4℃條件下浸提24h。進(jìn)一步地，在步驟(3)中，所述復(fù)合酶為由胰蛋白酶和羧肽酶a復(fù)合而成的復(fù)合酶，所述胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比為1.5:1。進(jìn)一步地，在步驟(4)中，所述0045型和002型蜂房式過濾器和中空纖維超濾柱購自北京旭邦膜設(shè)備有限公司；所述中空纖維超濾柱超濾的截留分子量為1500和2500da。進(jìn)一步地，在步驟(2)和(3)中所述微波功率為200-300w。本發(fā)明的目的之二采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：還提供一種如上所述的地龍蛋白多肽酒的制備方法，包括如下步驟：(1)將按照配方量的車前子、通草、澤瀉、燈心草配料，然后倒入部分黃酒浸提2-3個(gè)月，然后過濾，取上清液，得到藥材浸提液；(2)將地龍蛋白多肽加入至剩余黃酒中，攪拌均勻，并密封儲(chǔ)存1個(gè)月，得到地龍蛋白多肽混合酒；(3)將步驟(1)的藥材浸提液和步驟(2)的地龍蛋白多肽混合酒進(jìn)行勾兌，攪拌均勻，并密封儲(chǔ)存1個(gè)月，即得地龍蛋白多肽酒。進(jìn)一步地，步驟(1)中與步驟(2)中所述黃酒的用量比例為2:1。進(jìn)一步地，所述地龍蛋白多肽為分子量介于1500-2500da的地龍蛋白多肽，該地龍蛋白多肽由如下步驟制得：(1)浸提提?。喝⌒迈r的蚯蚓，在水中浸泡24h，使其吐出腸道中的泥土等異物；清洗干凈后，加入1.5倍體積的磷酸鹽緩沖溶液用組織搗碎機(jī)搗碎，攪拌，浸提15-30h，離心15min，取其上清液；(2)蛋白質(zhì)改性：步驟(1)得到的上清液，調(diào)ph值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波處理5分鐘得到改性蛋白溶液；(3)酶解：以改性蛋白溶液為底物，調(diào)ph值至6.3-6.5，按照底物質(zhì)量百分比為1.5-2％加入復(fù)合酶拌勻，然后在50-55℃下，微波處理5分鐘，得到酶解液；(4)分離純化的步驟：將酶解液降至室溫，取上清液，依次用0045和002型蜂房式濾器過濾除菌,而后用中空纖維超濾柱超濾，收集濾液冷凍干燥，即得地龍蛋白多肽。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明以地龍蛋白多肽為主要成分，配以車前子、通草、澤瀉、燈心草的中藥輔藥，制備得到具有增加排尿量、具有利尿活性的保健藥酒，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用，增強(qiáng)利尿活性，可長達(dá)7個(gè)小時(shí)，具有緩釋性特點(diǎn)，適應(yīng)于長期給藥，減少不良反應(yīng)。(2)此外，通過改進(jìn)地龍蛋白多肽的提取、酶解、純化分離技術(shù)，以浸提提取、超波輔助酶解、0045和002型蜂房式濾器過濾、用中空纖維超濾柱超濾分離純化，制備具有利尿活性的多肽，本發(fā)明制備的地龍蛋白多肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無疑對(duì)延長中草藥進(jìn)一步開發(fā)的產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高地龍產(chǎn)業(yè)綜合效益，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對(duì)推動(dòng)一帶一路建設(shè)有重大意義。(3)本發(fā)明整個(gè)地龍蛋白多肽的制備工藝以及地龍蛋白多肽酒的流程短、時(shí)間短，能耗低、污染少、不使用有毒試劑、無污染物排放，達(dá)到清潔生產(chǎn)目標(biāo)。(4)在控制酶解過程中酶的選擇是關(guān)鍵，它不僅影響最后地龍蛋白多肽的生理功能、地龍?jiān)侠寐剩乙仓苯佑绊懙佚埖鞍锥嚯木频娘L(fēng)味和物理化學(xué)特性。酶的選擇、酶解過程的控制是酶解法制備地龍蛋白多肽的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明經(jīng)過大量試驗(yàn)篩選出復(fù)合酶和中性蛋白酶來水解地龍蛋白，并且篩選出最優(yōu)的用酶條件，對(duì)地龍蛋白的酶解效果最好。由于各種酶由于酶作用位點(diǎn)的特異性，對(duì)同一底物地龍蛋白具有不同的水解能力。研究發(fā)現(xiàn)，尤其在胰蛋白酶和羧肽酶a用量比例為1.5:1使，其水解效果優(yōu)異，使其水解產(chǎn)物的水解度和肽得率都較高。(5)由本發(fā)明0045和002型蜂房式濾器過濾、用中空纖維超濾柱超濾進(jìn)行分離純化，既能出去細(xì)菌，還能將有機(jī)污染物和鹽分除去，達(dá)到提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的，得到的地龍蛋白多肽分子量介于1500-2500da，研究發(fā)現(xiàn)，分子量介于1500-2500da的地龍蛋白多肽利尿用強(qiáng)，而且研究還發(fā)現(xiàn)，并非肽分子量越小或越大其抗凝、利尿活性越強(qiáng)，肽的活性也受其氨基酸的組成、排序或肽的空間結(jié)構(gòu)等因素的影響，由本發(fā)明純化得到的分子量介于1500-2500da地龍蛋白多肽其活性最強(qiáng)。另外，本發(fā)明的分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡便經(jīng)濟(jì)。具體實(shí)施方式下面，結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，需要說明的是，在不相沖突的前提下，以下描述的各實(shí)施例之間或各技術(shù)特征之間可以任意組合形成新的實(shí)施例。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例1一種地龍蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：地龍蛋白多肽2份、車前子13份、通草12份、澤瀉6份、燈心草8份以及酒精濃度為10-15％的黃酒80份。實(shí)施例2一種地龍蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：地龍蛋白多肽1.5份、車前子8份、通草8份、澤瀉5份、燈心草5份以及酒精濃度為10-15％的黃酒75份。實(shí)施例3一種地龍蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：地龍蛋白多肽2.5份、車前子14份、通草14份、澤瀉8份、燈心草8份以及酒精濃度為10-15％的黃酒85份。實(shí)施例4實(shí)施例1-3的地龍蛋白多肽酒制備方法如下：(1)將按照配方量的車前子、通草、澤瀉、燈心草配料，然后倒入總量三分之二的黃酒浸提2.5個(gè)月，然后過濾，取上清液，得到藥材浸提液；(2)將地龍蛋白多肽加入總量三分之一的黃酒中，攪拌均勻，并密封儲(chǔ)存1個(gè)月，得到地龍蛋白多肽混合酒；所述地龍蛋白多肽為分子量介于1500-2500da的地龍蛋白多肽，該地龍蛋白多肽由如下步驟制得：(a)浸提提取：取新鮮的蚯蚓，在水中浸泡24h，使其吐出腸道中的泥土等異物；清洗干凈后，加入1.5倍體積的濃度為0.02mol/l、ph值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液用組織搗碎機(jī)搗碎，攪拌，在4℃條件下浸提24h，離心15min，取其上清液；(b)蛋白質(zhì)改性：步驟(1)得到的上清液，調(diào)ph值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波處理5分鐘得到改性蛋白溶液；(c)酶解：以改性蛋白溶液為底物，調(diào)ph值至6.3-6.5，按照底物質(zhì)量百分比為1.5-2％加入復(fù)合酶拌勻，然后在50-55℃下，微波處理5分鐘，得到酶解液；所述復(fù)合酶為由胰蛋白酶和羧肽酶a復(fù)合而成的復(fù)合酶，所述胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比為1.5:1。(d)分離純化的步驟：將酶解液降至室溫，取上清液，依次用0045和002型蜂房式濾器過濾除菌,而后用中空纖維超濾柱超濾，收集濾液冷凍干燥，即得地龍蛋白多肽。所述0045型和002型蜂房式過濾器和中空纖維超濾柱購自北京旭邦膜設(shè)備有限公司；所述中空纖維超濾柱超濾的截留分子量為1500和2500da。(3)將步驟(1)的藥材浸提液和步驟(2)的地龍蛋白多肽混合酒進(jìn)行勾兌，攪拌均勻，并密封儲(chǔ)存1個(gè)月，即得地龍蛋白多肽酒。對(duì)比例1與實(shí)施例1的區(qū)別在于在地龍蛋白多肽過程中，一次酶解的復(fù)合酶中胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比不在本發(fā)明限定的范圍內(nèi)，即為胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比1:1.5。對(duì)比例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于在地龍蛋白多肽過程中，去除浸提提取的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。對(duì)比例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于在地龍蛋白多肽過程中，去除分離純化的步驟，即去除0045和002型蜂房式濾器過濾、用中空纖維超濾柱超濾的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。下面，對(duì)本發(fā)明制備的地龍蛋白多肽的肽得率、純度以及利尿作用進(jìn)行測定與驗(yàn)證。1、肽得率的測定采用三氯乙酸(tca)沉淀法與甲醛滴定法相結(jié)合進(jìn)行測定。取10ml酶解液加10ml25％(g/g)tca，攪勻靜置半小時(shí)后在4800r/min下離心10min，所得的上清液記作上清液tca，分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定上清液中的總氮含量和氨態(tài)氮含量，則肽氮量和肽得率按下式進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表1：上清液總肽氮量＝上清液tca總氮量－上清液tca總氨態(tài)氮量，肽得率＝上清液總肽氮含量/原料總蛋白氮含量×100％。2、純度的測定以牛血清白蛋白(bsa)為標(biāo)準(zhǔn)品，制成不同濃度的bsa溶液。向7支試管中分別加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色溶液染色5min。以第1支試管中的溶液為空白對(duì)照，測定其余6支試管中溶液在595nm處的吸光度。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g·l-1)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。得到的線性回歸方程為y＝5.684x+0.142(r＝0.99)，線性范圍為0-1000μg。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，可以用來進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。分別吸取實(shí)施例1-3所得的地龍蛋白多肽作為供試品，在595nm處測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/％，結(jié)果如表1。表1地龍蛋白多肽的肽得率、純度肽得率(％)純度(％)實(shí)施例156.466.7實(shí)施例245.960.4實(shí)施例348.359.8對(duì)比例133.240.6對(duì)比例230.939.8對(duì)比例328.838.7表1結(jié)果顯示，本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的地龍蛋白多肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無疑對(duì)延長中藥產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高地龍產(chǎn)業(yè)綜合效益，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對(duì)推動(dòng)一帶一路建設(shè)有重大意義。3、利尿作用的驗(yàn)證本申請通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測定對(duì)水負(fù)荷大鼠的排尿量的影響，證明地龍蛋白多肽酒具有利尿作用，而且具有緩釋性特點(diǎn)，適用于長期給藥，減少不良反應(yīng)。31.實(shí)驗(yàn)儀器小鼠代謝籠；電子天平，精度:0.1mg。32.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料昆明種小白鼠，20±2g，雌雄各半，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；蒸餾水。33.實(shí)驗(yàn)方法所有小鼠飼養(yǎng)條件一致，實(shí)驗(yàn)前3天置于同一實(shí)驗(yàn)室觀察飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，各組飼料與飲用水完全相同。小鼠隨機(jī)分組，每組16只，雌雄各半，分為七組，分別為空白組，實(shí)施例1組、實(shí)施例2組、實(shí)施例3組、對(duì)比例1組、對(duì)比例2組、對(duì)比例3組，給藥量均為60ml/kg，空白對(duì)照組給予同等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，實(shí)驗(yàn)期間禁食禁水。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，實(shí)驗(yàn)時(shí)禁食禁水。每日1次，測量7小時(shí)的尿量。重復(fù)測量6次。每次測量首先輕壓小鼠下腹排盡余尿，各組小鼠灌胃給予各藥，記錄給藥時(shí)間。將小鼠分別放入代謝籠中，每小時(shí)用電子天平稱量尿液收集器1次，連續(xù)觀察記錄7小時(shí)。34.實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用spss10·0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行成組t檢驗(yàn)(完全隨機(jī)設(shè)計(jì)計(jì)量資料兩均數(shù)比較的t檢驗(yàn))。表2.各藥物組7小時(shí)尿量(g)與空白組比較尿量增加有顯著差異,*p<0.05,**p<0.01。表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，實(shí)施例1-3以及對(duì)比例1-3給藥組均表現(xiàn)出一定程度的利尿活性，實(shí)施例1-3表現(xiàn)出明顯的利尿活性，尤其是實(shí)施例1的利尿活性最為有益。另外，本發(fā)明的地龍蛋白多肽酒的利尿特性持續(xù)穩(wěn)定，可長達(dá)7個(gè)小時(shí)，具有緩釋性特點(diǎn)，適應(yīng)于長期給藥，減少不良反應(yīng)。而對(duì)比例1雖然有一定的利尿活性，但是其效果與實(shí)施例1-3相比，卻大打折扣，這可能由于在地龍蛋白多肽過程中，酶解的復(fù)合酶中胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比不在本發(fā)明限定的范圍內(nèi)導(dǎo)致，說明復(fù)合酶的篩選對(duì)本發(fā)明地龍蛋白多肽的提取率以及純度有一定的影響。而對(duì)比例2雖然有一定的利尿活性，但是其效果與實(shí)施例1-3相比，卻也大打折扣，這可能由于在地龍蛋白多肽過程中，去除浸提提取步驟的緣故導(dǎo)致，說明超聲提取對(duì)本發(fā)明地龍蛋白多肽的提取率以及純度有一定的影響。而對(duì)比例3雖然有一定的利尿活性，但是其效果與實(shí)施例1-3相比，卻也大打折扣，這可能由于在地龍蛋白多肽過程中，去除分離純化的步驟，即去除用0045和002型蜂房式濾器過濾的步驟和用中空纖維超濾柱超濾的緣故導(dǎo)致，說明超濾對(duì)地龍蛋白多肽的提取率以及純度有一定的影響。綜上所述，在制備地龍蛋白多肽過程中，各個(gè)步驟是相輔相成的，各個(gè)步驟的綜合才能得到本發(fā)明具有明顯抗凝血作用的地龍蛋白多肽酒。上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁12