本發(fā)明涉及一種烏奴龍膽苷a的提取方法及其制備止咳藥物的用途。
背景技術(shù)：
千百年來(lái)藏藥在解除藏族人民的疾病痛苦方面發(fā)揮著巨大作用。大花龍膽gentianaszechenyiikanitz和烏奴龍膽gentianaurnulah.smith均為常用藏藥，屬于龍膽科龍膽屬植物，主產(chǎn)于西藏、青海西南部，多生長(zhǎng)在海拔3000米以上的高山草地或高山礫石帶、高山草甸及流石灘等地。以大花龍膽為主流品種的白花龍膽，應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病已有一千多年的歷史，且療效顯著?！恫厮帢?biāo)準(zhǔn)》(西藏等六省衛(wèi)生局編1979)記載白花龍膽(處方名為龍膽花，藏文音譯名為榜間嘎保)功效在于清熱解毒，瀉肝膽實(shí)火，用于喉部疾病，腦膜炎、肝炎、胃炎等。以白花龍膽為君藥的十五味龍膽花丸、三味龍膽花丸和十味龍膽花丸等常用藏成藥主要用于治療肺熱咳嗽等疾病，因療效確切而行銷(xiāo)全國(guó)。烏奴龍膽的應(yīng)用歷史也非常悠久，《月王藥診》就有記載(藏藥音譯為崗嘎穹)?！恫厮帢?biāo)準(zhǔn)》謂其功效于清熱解毒，止熱瀉，用于咽喉腫痛、感冒發(fā)燒、熱性病腹瀉等。因化學(xué)成分和藥理實(shí)驗(yàn)方面研究較少，大花龍膽(白花龍膽的主流品種)和烏奴龍膽的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。目前尚沒(méi)有大花龍膽化學(xué)成分的研究報(bào)道。劉艷紅等對(duì)烏奴龍膽的化學(xué)成分進(jìn)行了研究(云南植物研究，1994，16(4)：417-423)，從中分離鑒定了5個(gè)環(huán)烯醚萜苷，即烏奴龍膽苷(gentioumoside)a-e，其中烏奴龍膽苷a、b和c是二聚環(huán)烯醚萜苷。本課題組對(duì)大花龍膽的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)烏奴龍膽苷a在大花龍膽中含量也很高，并以烏奴龍膽苷a為指標(biāo)性成分分別建立了白花龍膽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(宗留留等，中國(guó)中藥雜志，2015，40(10)：1872-1876)和烏奴龍膽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(宗留留等，中國(guó)中藥雜志，2015，40(19)：3878-3882)。而對(duì)烏奴龍膽苷a的提取分離優(yōu)化及其藥效學(xué)研究，既可闡明所建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性，也利于開(kāi)發(fā)新的藏藥止咳藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種烏奴龍膽苷a的提取方法及其在制備止咳藥物中的用途，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)性研究，闡明該化合物的止咳作用，以便能在臨床更好應(yīng)用。
本發(fā)明提供的所述烏奴龍膽苷a的分子式：c40h52o22，分子量：884.29。
所述的烏奴龍膽苷a采用如下的提取方法獲得：取大花龍膽或?yàn)跖埬懰幉拇址?，?0-50倍量的水，煎煮或回流提取1-3次，每次1-3小時(shí)，離心后取上清液，合并上清液全部通過(guò)大孔樹(shù)脂柱吸附；依次用水、30-35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液沖洗大孔樹(shù)脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脫流分，濃縮得40％乙醇洗脫部位；將40％乙醇洗脫部位先后經(jīng)凝膠sephadexlh-20柱層析和硅膠柱層析分離，合并烏奴龍膽苷a流份，得到烏奴龍膽苷a純品。
本發(fā)明所述的烏奴龍膽苷a可以是從含烏奴龍膽苷a的各種藥材中如大花龍膽、烏奴龍膽中提取獲得烏奴龍膽苷a粗品或?yàn)跖埬戃誥單體化合物。
優(yōu)選的，其中水提取物通過(guò)d101大孔樹(shù)脂柱洗脫，先后經(jīng)凝膠sephadexlh-20柱層析(甲醇系統(tǒng))和硅膠柱層析(乙酸乙酯-甲醇-水10∶1.5∶1系統(tǒng))分離，合并烏奴龍膽苷a流份，得到烏奴龍膽苷a純品。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供烏奴龍膽苷a在制備治療咳嗽藥物中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，其中所述烏奴龍膽苷a用于治療肺熱咳嗽、感冒咳嗽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療咳嗽的藥物制劑，該制劑以烏奴龍膽苷a作為活性成分與藥學(xué)上可以接受的載體相結(jié)合制成藥學(xué)上可以接受的劑型。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明：烏奴龍膽苷a可延長(zhǎng)由濃氨水所致實(shí)驗(yàn)性小鼠咳嗽模型中小鼠的咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)，也可延長(zhǎng)由枸櫞酸所致實(shí)驗(yàn)性豚鼠咳嗽模型中豚鼠的咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數(shù)，表明烏奴龍膽苷a具備良好的止咳效果，為臨床治療咳嗽提供新的選擇，具有良好藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。
具體實(shí)施方式
以下將對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述，應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1：從大花龍膽藥材中分離烏奴龍膽苷a
取大花龍膽藥材粗粉20g，加25倍量的水，加熱回流提取3次，每次1小時(shí)，離心后取上清液，合并上清液，全部通過(guò)d101大孔樹(shù)脂柱吸附；依次用水、35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液沖洗大孔樹(shù)脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脫流分；將40％乙醇洗脫流分減壓濃縮干燥后得浸膏327.0mg，浸膏用甲醇溶解后采用甲醇系統(tǒng)經(jīng)凝膠sephadexlh-20柱層析分離，收集烏奴龍膽a流份，減壓濃縮干燥后得浸膏203.7mg，再采用乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1.5∶1)系統(tǒng)為流動(dòng)相經(jīng)硅膠柱層析分離，合并烏奴龍膽苷a流份，減壓濃縮干燥后得到烏奴龍膽苷a純品119.8mg。經(jīng)與文獻(xiàn)(劉艷紅等，云南植物研究，1994，16(4)：417-423)報(bào)道的烏奴龍膽苷a的1h-nmr、13c-nmr比較，確定為烏奴龍膽苷a結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2：從烏奴龍膽藥材中分離烏奴龍膽苷a
取烏奴龍膽藥材粗粉20g，加25倍量的水，加熱回流提取3次，每次1小時(shí)，離心后取上清液，合并上清液全部通過(guò)d101大孔樹(shù)脂柱吸附；依次用水、35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液沖洗大孔樹(shù)脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脫流分；將40％乙醇洗脫流分減壓濃縮干燥后得浸膏142.0mg，浸膏用甲醇溶解后采用甲醇系統(tǒng)經(jīng)凝膠sephadexlh-20柱層析分離，收集烏奴龍膽a流份，減壓濃縮干燥后得浸膏81.6mg，再采用乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1.5∶1)系統(tǒng)為流動(dòng)相經(jīng)硅膠柱層析分離，合并烏奴龍膽苷a流份，減壓濃縮干燥后得到烏奴龍膽苷a純品33.2mg。經(jīng)與文獻(xiàn)(劉艷紅等，云南植物研究，1994，16(4)：417-423)報(bào)道的烏奴龍膽苷a的1h-nmr、13c-nmr比較，確定為烏奴龍膽苷a結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3：對(duì)濃氨水所致的小鼠咳嗽的影響
(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物icr小鼠，雌雄各半，清潔級(jí)，20±2g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk(滬)2013-0016。
(2)試藥與儀器25％濃氨水(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸可待因片(30mg/片，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)有限公司，批號(hào)：20130401)；402ai型超聲波霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；陽(yáng)性藥磷酸可待因片的人最大日用量為8片(30mg/片)，小鼠等效換算劑量為30mg/kg；烏奴龍膽苷a的給藥劑量參照陽(yáng)性藥給藥劑量，高、中、低劑量分別為60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg。
(3)實(shí)驗(yàn)方法采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法，考慮性別和體重的組間均衡性，分成5組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12h，然后各組小鼠按0.2ml/10g灌胃給藥，1次/天，每天同一時(shí)間灌胃，連續(xù)3天。末次給藥1h后將各組小鼠逐只放入1l密閉燒杯內(nèi)，用超聲霧化器以一固定霧量向內(nèi)噴25％濃氨水5s后，保持密閉環(huán)境，觀(guān)察并記錄小鼠咳嗽潛伏期和2min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)完后更換新的25ml濃氨水。運(yùn)用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表1烏奴龍膽苷a對(duì)濃氨水所致小鼠咳嗽的影響
備注：與空白組比較：*為p＜0.05，**為p＜0.01，***為p＜0.001
(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)論與空白組比較，烏奴龍膽苷a高、中劑量組均能延長(zhǎng)濃氨水所致小鼠咳嗽的潛伏期(p＜0.05)，烏奴龍膽苷a高、中、低劑量組均能明顯縮短濃氨水所致小鼠咳嗽的次數(shù)(p＜0.05)?？梢哉J(rèn)為烏奴龍膽苷a具有明顯的止咳效果。
實(shí)施例4：對(duì)枸櫞酸所致的豚鼠咳嗽的影響
(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豚鼠，200±50g，清潔級(jí)，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk(滬)2012-0008。
(2)試藥與儀器磷酸可待因片(30mg/片，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)有限公司，批號(hào)：20130401)；402ai型超聲波霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；枸櫞酸(分析純，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150701)；陽(yáng)性藥磷酸可待因片的人最大日用量為8片(30mg/片)，豚鼠的等效劑量為20mg/kg；烏奴龍膽苷a的給藥劑量參照陽(yáng)性藥給藥劑量，高、中、低劑量分別為40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg。
(3)實(shí)驗(yàn)方法用17.5％枸櫞酸水溶液噴霧篩選出咳嗽敏感豚鼠，雌雄各半。置于口朝上的4l玻璃鐘罩內(nèi)，蓋好蓋子形成密封可視容器，上端接通超聲霧化器以最大霧量噴霧15s，5min鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)10-30次為哮喘敏感。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法，考慮性別和體重的組間均衡性，將篩選哮喘敏感豚鼠分成5組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前豚鼠禁食不禁水6h，然后各組豚鼠按1ml/200g灌胃給藥，1次/天，每天同一時(shí)間灌胃，連續(xù)3天。末次給藥1h后以最大霧量噴霧15s，記錄5min內(nèi)豚鼠咳嗽次數(shù)。每組完后更換新的25ml17.5％枸櫞酸水溶液。運(yùn)用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表2烏奴龍膽苷a對(duì)枸櫞酸所致豚鼠咳嗽的影響
備注：與空白組比較：*為p＜0.05，**為p＜0.01，***為p＜0.001
(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)論與空白組比較，烏奴龍膽苷a高、中、低劑量組均能明顯縮短濃氨水所致豚鼠咳嗽的咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)(p＜0.05)?？梢哉J(rèn)為烏奴龍膽苷a具有明顯的止咳效果。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，只用于對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。