技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因及snp標(biāo)記篩查的擴(kuò)增引物和方法。
背景技術(shù)：
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凡納濱對(duì)蝦(litopenaeusvannamei)俗稱南美白對(duì)蝦，原產(chǎn)于南美洲，從墨西哥西南沿海至秘魯西部的太平洋沿岸均有分布，是全世界產(chǎn)量最大的養(yǎng)殖對(duì)蝦。在我國(guó)，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)域遍布于全國(guó)沿海的海水養(yǎng)殖區(qū)和內(nèi)陸的淡水養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖面積約25萬(wàn)公頃，年產(chǎn)量超過(guò)100萬(wàn)噸，海水養(yǎng)殖區(qū)和淡水養(yǎng)殖區(qū)產(chǎn)量各約占50％，年產(chǎn)值300-400億元人民幣，是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)。凡納濱對(duì)蝦在海水和淡水中均能成活，這與其強(qiáng)大的滲透壓調(diào)節(jié)能力有著密切的關(guān)系，而在凡納濱對(duì)蝦的滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程中滲透壓調(diào)節(jié)基因起著至關(guān)重要的作用。
在滲透壓調(diào)節(jié)基因中，na,k-atpase基因的作用尤為突出。na,k-atpase是有機(jī)體賴以生存的重要膜蛋白，參與細(xì)胞兩側(cè)na+、k+離子的跨膜主動(dòng)運(yùn)輸，在維持細(xì)胞的膜電位及細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，為細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)離子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及排出代謝產(chǎn)物提供驅(qū)動(dòng)力等方面起重要作用。na,k-atpase基因是甲殼動(dòng)物重要的滲透壓調(diào)節(jié)基因，研究顯示在低鹽度應(yīng)激后凡納濱對(duì)蝦組織中na,k-atpase基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明na,k-atpase基因是一個(gè)與凡納濱對(duì)蝦鹽度抗逆相關(guān)的功能基因，可望用于凡納濱對(duì)蝦耐低鹽分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，加快凡納濱對(duì)蝦耐低鹽優(yōu)良品種的選育進(jìn)程。
在國(guó)際上，以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)已成為當(dāng)代水產(chǎn)育種的關(guān)鍵技術(shù)。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)即snp，是指由基因組單核苷酸變異(包括堿基轉(zhuǎn)換、顛換、單堿基插入或缺失等)所引起的dna序列多態(tài)性，是最新的第三代dna分子標(biāo)記。因其具有數(shù)量巨大、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、測(cè)定準(zhǔn)確簡(jiǎn)便、能顯示其他技術(shù)無(wú)法檢測(cè)的隱藏多態(tài)性以及可能與基因功能相關(guān)的眾多優(yōu)點(diǎn)，在親子鑒定和分子標(biāo)記輔助育種中得到廣泛應(yīng)用。迄今，利用凡納濱對(duì)蝦功能基因已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多個(gè)與性狀相關(guān)的snp標(biāo)記，如在凡納濱對(duì)蝦α淀粉酶(amy)基因上發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的snp位點(diǎn)，在熱休克蛋白60(hsp60)家族成員tcp-1的同源基因tcp-1-eta基因上發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與凡納濱對(duì)蝦耐寒性狀相關(guān)的snp位點(diǎn)，在凡納濱對(duì)蝦過(guò)氧化氫酶(cat)基因上發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與對(duì)蝦抗wssv性狀顯著相關(guān)的snp位點(diǎn)。但尚未有與凡納濱對(duì)蝦耐低鹽性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因及snp標(biāo)記篩查的擴(kuò)增引物和方法。利用凡納濱對(duì)蝦鹽度抗逆相關(guān)功能基因開(kāi)發(fā)snp標(biāo)記，為進(jìn)一步篩選與凡納濱對(duì)蝦鹽度抗逆相關(guān)的snp標(biāo)記和開(kāi)發(fā)用于凡納濱對(duì)蝦親子鑒定的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，從而加快凡納濱對(duì)蝦抗逆優(yōu)良品種的選育進(jìn)程。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明以通過(guò)ncbi獲得的凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的完整mrna序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行該基因全基因序列的獲取，并針對(duì)所獲得的na,k-atpaseα亞基的全基因序列進(jìn)行snp位點(diǎn)篩查，開(kāi)發(fā)凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因的snp標(biāo)記，并提供snp位點(diǎn)擴(kuò)增引物，建立凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標(biāo)記開(kāi)發(fā)的技術(shù)體系，為進(jìn)一步篩選與凡納濱對(duì)蝦鹽度抗逆相關(guān)的snp標(biāo)記和開(kāi)發(fā)用于凡納濱對(duì)蝦親子鑒定的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因擴(kuò)增引物，包括12對(duì)擴(kuò)增引物：
引物對(duì)1：glvnk-f1：5’-cacagacggtgaagaatg-3’；
glvnk-r1：5’-tgggaccttgtgctcatc-3’；
引物對(duì)2：glvnk-f2：5’-tggaacttgatgagcacaa-3’；
glvnk-r2：5’-ggcaatgaagcagaggata-3’；
引物對(duì)3：glvnk-f3：5’-ctcctgctgtggattggc-3’；
glvnk-r3：5’-atgagaagacgcctgtga-3’；
引物對(duì)4：glvnk-f4：5’-ggagcccaacaaggacaa-3’；
glvnk-r4：5’-gacagcattggtggagaa-3’；
引物對(duì)5：glvnk-f5：5’-ttctccaccaatgctgtc-3’；
glvnk-r5：5’-ggctacaatgataccaatgag-3’；
引物對(duì)6：glvnk-f6：5’-tgttgtgttcctcattggt-3’；
glvnk-r6：5’-cagtctcgtggatggatac-3’；
引物對(duì)7：glvnk-f7：5’-caagtatccatccacgaga-3’；
glvnk-r7：5’-agcctttgcttcagtggg-3’；
引物對(duì)8：glvnk-f8：5’-attcccatcaaggaggtt-3’；
glvnk-r8：5’-ggatgttagatgtcagggt-3’；
引物對(duì)9：glvnk-f9：5’-cctgacatctaacatccctgag-3’；
glvnk-r9：5’-gcttgtcggtgaatgggt-3’；
引物對(duì)10：glvnk-f10：5’-cctgccatttcccttgcc-3’；
glvnk-r10：5’-cgctcacggagaccaaag-3’；
引物對(duì)11：glvnk-f11：5’-atcatggctgagaacggcttcc-3’；
glvnk-r11：5’-tggagaacggaagagcag-3’；
引物對(duì)12：glvnk-f12：5’-ttccgttctccatcctta-3’；
glvnk-r12：5’-atggagcagtagttgacc-3’。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因的擴(kuò)增方法，包括以下步驟：以凡納濱對(duì)蝦基因組dna為模板，分別以上述的引物對(duì)glvnk-f1/glvnk-r1、glvnk-f2/glvnk-r2、glvnk-f3/glvnk-r3、glvnk-f4/glvnk-r4、glvnk-f5/glvnk-r5、glvnk-f6/glvnk-r6、glvnk-f7/glvnk-r7、glvnk-f8/glvnk-r8、glvnk-f9/glvnk-r9、glvnk-f10/glvnk-r10、glvnk-f11/glvnk-r11和glvnk-f12/glvnk-r12作為擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，然后再進(jìn)行序列拼接，獲得凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列。
所述的pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)體系優(yōu)選為25μl，包括：不含mg2+的10×pcrbuffer2.5μl、25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl、5u/μllataq酶0.2μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、dna模板12.5ng，其余由無(wú)菌水補(bǔ)足至25μl。
所述的pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標(biāo)記篩查的擴(kuò)增引物，包括13對(duì)擴(kuò)增引物：
引物對(duì)13：lvnk001-lvnk011-f：5’-tggaacttgatgagcacaa-3’；
lvnk001-lvnk011-r：5’-ggcaatgaagcagaggata-3’；
引物對(duì)14：lvnk012-lvnk023-f：5’-ctcctgctgtggattggc-3’；
lvnk012-lvnk023-r：5’-gactttgcctcctgatag-3’；
引物對(duì)15：lvnk024-lvnk027-f：5’-ggcgtcttctcctactatca-3’；
lvnk024-lvnk027-r：5’-aaagcaaagggaaagtga-3’；
引物對(duì)16：lvnk028-lvnk030-f：5’-gcagttgtacctgggcattg-3’；
lvnk028-lvnk030-r：5’-gacagcattggtggagaa-3’；
引物對(duì)17：lvnk031-lvnk036-f：5’-ttctccaccaatgctgtc-3’；
lvnk031-lvnk036-r：5’-ggctacaatgataccaatgag-3’；
引物對(duì)18：lvnk037-lvnk039-f：5’-tgttgtgttcctcattggt-3’；
lvnk037-lvnk039-r：5’-aggtaggcattgttgaaag-3’；
引物對(duì)19：lvnk040-lvnk042-f：5’-attcccatcaaggaggtt-3’；
lvnk040-lvnk042-r：5’-ggatgttagatgtcagggt-3’；
引物對(duì)20：lvnk043-lvnk046-f：5’-cattgcttacaccctgac-3’；
lvnk043-lvnk046-r：5’-cagggaatgaacttgtagg-3’；
引物對(duì)21：lvnk047-lvnk052-f：5’-tatttaggtgcctgccattt-3’；
lvnk047-lvnk052-r：5’-aggacgaaataagtgggt-3’；
引物對(duì)22：lvnk053-lvnk055-f：5’-tcgtttagtttacccact-3’；
lvnk053-lvnk055-r：5’-tgtggctatgtagatgga-3’；
引物對(duì)23：lvnk056-lvnk063-f：5’-ttcagaagggatttcgtc-3’；
lvnk056-lvnk063-r：5’-gtccatagtgatcctcca-3’；
引物對(duì)24：lvnk064-lvnk074-f：5’-acaacaggctcatctcaa-3’；
lvnk064-lvnk074-r：5’-ctggtggacaatggagtt-3’；
引物對(duì)25：lvnk075-lvnk078-f：5’-gccgtaactccattgtcc-3’；
lvnk075-lvnk078-r：5’-tggagaacggaagagcag-3’。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標(biāo)記的篩查方法，包括以下步驟：分別以若干個(gè)不同來(lái)源的凡納濱對(duì)蝦基因組dna為模板，分別以上述的引物對(duì)lvnk001-lvnk011-f/lvnk001-lvnk011-r、lvnk012-lvnk023-f/lvnk012-lvnk023-r、lvnk024-lvnk027-f/lvnk024-lvnk027-r、lvnk028-lvnk030-f/lvnk028-lvnk030-r、lvnk031-lvnk036-f/lvnk031-lvnk036-r、lvnk037-lvnk039-f/lvnk037-lvnk039-r、lvnk040-lvnk042-f/lvnk040-lvnk042-r、lvnk043-lvnk046-f/lvnk043-lvnk046-r、lvnk047-lvnk052-f/lvnk047-lvnk052-r、lvnk053-lvnk055-f/lvnk053-lvnk055-r、lvnk056-lvnk063-f/lvnk056-lvnk063-r、lvnk064-lvnk074-f/lvnk064-lvnk074-r、lvnk075-lvnk078-f/lvnk075-lvnk078-r作為擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將每對(duì)引物擴(kuò)增模板得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序圖作為一組進(jìn)行比較，篩查得到snp位點(diǎn)。
所述的pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)體系優(yōu)選為25μl，包括：不含mg2+的10×pcrbuffer2.5μl、25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl、5u/μl高保真pcr酶0.2μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、dna模板12.5ng，其余由無(wú)菌水補(bǔ)足至25μl。
所述的pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。
所述的凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因有78個(gè)snp位點(diǎn)，分別為seqidno.2所示核苷酸序列自5’端起第672位堿基是a或g、第711位堿基是t或c、第752位堿基是a或g、第773位堿基是a或c、第785位堿基是t或c、第796位堿基是a或t、第813位堿基是a或t、第846位堿基是t或c、第860位堿基是a或g、第865位堿基是t或c、第902位堿基是t或c、第1106位堿基是a或t、第1142位堿基是t或c、第1155位堿基是t或c、第1207位堿基是a或g、第1210位堿基是a或g、第1213位堿基是a或t、第1436位堿基是a或t、第1439位堿基是t或g、第1488位堿基是g或c、第1542位堿基是a或t、第1547位堿基是t或g、第1652位堿基是t或c、第1852位堿基是a或g、第1954位堿基是a或t、第1980位堿基是a或c、第1985位堿基是a或g、第2743位堿基是a或t、第2753位堿基是t或g、第2855位堿基是t或c、第3032位堿基是t或c、第3034位堿基是a或g、第3078位堿基是a或g、第3326位堿基是a或t、第3368位堿基是a或c、第3466位堿基是a或t、第3912位堿基是t或c、第4029位堿基是t或c、第4041位堿基是t或c、第4548位堿基是a或g、第4677位堿基是t或c、第4754位堿基是a或t、第5221位堿基是a或t、第5222位堿基是a或t、第5641位堿基是t或c、第5650位堿基是a或t、第8384位堿基是a或g、第8454位堿基是a或g、第8507位堿基是a或g、第8520位堿基是a或t、第8559位堿基是t或g、第8593位堿基是a或g、第8796位堿基是t或g、第8827位堿基是a或t、第8838位堿基是t或c、第10799位堿基是t或g、第10903位堿基是t或c、第10942位堿基是a或t、第10965位堿基是a或c、第11008位堿基是t或c、第11030位堿基是t或g、第11057位堿基是a或c、第11217位堿基是a或t、第11267位堿基是t或c、第11272位堿基是a或g、第11289位堿基是t或g、第11290位堿基是t或c、第11298位堿基是t或c、第11299位堿基是a或t、第11300位堿基是a或t、第11309位堿基是t或c、第11312位堿基是t或g、第11375位堿基是a或g、第11388位堿基是t或c、第11649位堿基是a或g、第11663位堿基是a或t、第11678位堿基是t或c、第11689位堿基是a或t。
本發(fā)明從ncbi中獲得凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的完整mrna序列(genbank：kf765670.1)，并基于該序列設(shè)計(jì)12對(duì)引物，通過(guò)pcr擴(kuò)增、測(cè)序及序列拼接，獲得全長(zhǎng)為12452bp的凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列。針對(duì)所獲得的na,k-atpaseα亞基的全基因序列分段設(shè)計(jì)引物，采用不同來(lái)源的凡納濱對(duì)蝦基因組dna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)序方法進(jìn)行snp位點(diǎn)篩查，共獲得78個(gè)snp位點(diǎn)。本發(fā)明建立了凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因snp標(biāo)記開(kāi)發(fā)的技術(shù)體系，為進(jìn)一步篩選與凡納濱對(duì)蝦鹽度抗逆相關(guān)的snp標(biāo)記和開(kāi)發(fā)用于凡納濱對(duì)蝦親子鑒定的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，從而加快凡納濱對(duì)蝦抗逆優(yōu)良品種的選育進(jìn)程。
附圖說(shuō)明：
圖1是凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因結(jié)構(gòu)圖；其中，數(shù)字代表核苷酸數(shù)，淺灰色代表外顯子，深灰色代表內(nèi)含子。
具體實(shí)施方式：
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法或者按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得?？寺y(cè)序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。
1、凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基完整基因序列的獲取
1.1凡納濱對(duì)蝦基因組dna的提取
取凡納濱對(duì)蝦肌肉組織，采用海洋動(dòng)物組織基因組dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡納濱對(duì)蝦基因組dna，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；蚪Mdna定量采用nanodroptm2000分光光度計(jì)完成，質(zhì)量采用瓊脂糖電泳來(lái)檢測(cè)。
1.2pcr引物設(shè)計(jì)
以從ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中獲得的凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的完整mrna序列(genbank：kf765670.1)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物用以獲取na,k-atpaseα亞基的全基因序列。引物設(shè)計(jì)的要求為：引物長(zhǎng)度18-22bp，gc含量為40-60％，tm值為50-62℃，上下游引物的tm值之差不大于5，并盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)及錯(cuò)配等。共設(shè)計(jì)和合成12對(duì)pcr引物，引物序列見(jiàn)表1：
表1用于凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列獲取的引物及擴(kuò)增產(chǎn)物特征
注：括號(hào)中的數(shù)字表示引物序列對(duì)應(yīng)于凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基mrna序列(genbank:kf765670.1)的核苷酸位置
1.3pcr擴(kuò)增、測(cè)序及序列拼接
以上述提取的凡納濱對(duì)蝦基因組dna為模板，分別采用表1中設(shè)計(jì)的12對(duì)引物對(duì)該dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系25μl，包括：10×pcrbuffer(withoutmg2+)2.5μl、mgcl2(25mm)2.0μl，dntp(10mm)0.5μl、lataq酶(5u/μl)0.2μl、正向引物(10μm)0.5μl、反向引物(10μm)0.5μl、dna模板(25ng/μl)0.5μl、無(wú)菌水18.3μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，顯示該12對(duì)引物均能穩(wěn)定擴(kuò)增出單一條帶。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果顯示有4對(duì)引物擴(kuò)增出目的核苷酸序列，有8對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物除包含目的核苷酸序列外，還包含內(nèi)含子序列。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，獲得全長(zhǎng)為12452bp的凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列(如seqidno.1所示)，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成(圖1)。
2、凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的全基因序列snp位點(diǎn)篩查
2.1不同來(lái)源凡納濱對(duì)蝦基因組dna的提取
選取來(lái)自于廣東深圳、珠海、湛江、徐聞和茂名等地24個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的凡納濱對(duì)蝦24尾，分別取肌肉組織，采用海洋動(dòng)物組織基因組dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡納濱對(duì)蝦基因組dna，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。基因組dna定量采用nanodroptm2000分光光度計(jì)完成，質(zhì)量采用瓊脂糖電泳來(lái)檢測(cè)。
2.2pcr引物設(shè)計(jì)
以本研究中獲得的凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基的完整基因序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)為基礎(chǔ)分段設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)的要求為：引物長(zhǎng)度18-22bp，gc含量為40-60％，tm值為50-62℃，上下游引物的tm值之差不大于5，并盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)及錯(cuò)配等。共設(shè)計(jì)和合成25對(duì)pcr引物，引物序列見(jiàn)表2：
表2用于凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列snp位點(diǎn)篩查的引物及擴(kuò)增產(chǎn)物特征
注：括號(hào)中的數(shù)字表示引物序列對(duì)應(yīng)于凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)的核苷酸位置
2.3snp位點(diǎn)的篩查及snp位點(diǎn)基因型分析
以步驟2.1提取的24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna為模板，分別采用表2中的25對(duì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟1.3中所述基本一致，不同點(diǎn)在于：用于篩選snp位點(diǎn)的pcr體系中以高保真pcr酶(
表3凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基全基因序列中的snp位點(diǎn)及基因型特征
序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所
<120>凡納濱對(duì)蝦na,k-atpaseα亞基基因及snp標(biāo)記篩查的擴(kuò)增引物和方法
<160>4
<210>1
<211>12452
<212>dna
<213>凡納濱對(duì)蝦（litopenaeusvannamei）
<400>1
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gtatatacagtgattgttggtgctggtttgagagccagcgcgtcgccgttgttcgtggat240
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