本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及瑞士乳桿菌grx09及其在制備弱后酸化食品，特別是發(fā)酵乳中的制備。
技術(shù)背景
我國對發(fā)酵劑的研究相對較晚，一些大型乳品企業(yè)使用的發(fā)酵劑大多依賴進(jìn)口，如羅素、丹麥漢森、dsm等公司的產(chǎn)品。進(jìn)口乳酸菌發(fā)酵劑針對中國乳品生產(chǎn)現(xiàn)狀開發(fā)的較少，且價格較高，使得生產(chǎn)成本較高。隨著我國發(fā)酵食品行業(yè)的快速發(fā)展，對發(fā)酵劑行業(yè)提出了新的要求，需求量連年上升，特別是研制具有特殊性能的優(yōu)良發(fā)酵劑尤為重要。
發(fā)酵乳是含活菌的乳制品，發(fā)酵結(jié)束后，在貯存、運(yùn)輸和銷售過程中，菌體仍然能夠利用乳糖進(jìn)行生長繁殖，產(chǎn)生乳酸，使得發(fā)酵乳的酸度繼續(xù)升高。后酸化是影響發(fā)酵乳貯藏期間感官品質(zhì)和風(fēng)味特性的重要因素，是決定產(chǎn)品貨架期的重要指標(biāo)。因此研究和選育弱后酸化發(fā)酵劑菌種，優(yōu)化復(fù)合發(fā)酵劑的制備條件，開發(fā)高品質(zhì)弱后酸化復(fù)合發(fā)酵劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于研究和開發(fā)一種后酸化較弱的復(fù)合發(fā)酵劑，該復(fù)合發(fā)酵劑制備的發(fā)酵乳貯藏期間后酸較弱，且發(fā)酵乳感官品質(zhì)較高，狀態(tài)較好。
本發(fā)明公開了一株瑞士乳桿菌grx09(lactobacillushelveticusgrx09)，它的保藏號為cgmccno：14073。
本發(fā)明還公開了瑞士乳桿菌grx09在制備后酸化弱的發(fā)酵食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還公開了一種弱后酸化復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑，由瑞士乳桿菌grx09和嗜熱鏈球菌grx02(cgmccno：2525)組成，活菌數(shù)比為2:1。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑的制備過程包括：乳酸菌高密度培養(yǎng)、菌體離心濃縮、預(yù)培養(yǎng)、真空冷凍干燥。
進(jìn)一步地，本發(fā)明公開了一種后酸化弱的發(fā)酵食品的制備方法，是采用上述弱后酸化復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑用于發(fā)酵乳制備。
本發(fā)明中所述的發(fā)酵食品主要是指發(fā)酵乳(飲料)制品。具體制備方法是：
12％(w/w)復(fù)原牛乳中添加6％(w/w)蔗糖，經(jīng)均質(zhì)，熱處理，接種復(fù)合乳酸菌混合發(fā)酸劑，經(jīng)發(fā)酵制備。
利用本發(fā)明所提供的復(fù)合發(fā)酵劑制備的發(fā)酵牛乳不僅質(zhì)構(gòu)狀態(tài)較好，且后酸化較弱。發(fā)酵乳在4℃貯藏溫度下貯藏21天，酸度增長小于15°t。
附圖說明
圖1為菌株lh-1、grx09和sh的16srrna–pcr產(chǎn)物。泳道1為lh-1，2為grx09，3為sh。
本發(fā)明所述的瑞士乳桿菌grx09(lactobacillushelveticusgrx09)，于2017年4月25日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為cgmccno：14073。
具體實(shí)施方式
本研究利用從傳統(tǒng)發(fā)酵劑中篩選獲得的乳酸菌，研究其生長速率和貯藏特性，通過菌株之間的生長關(guān)系和不同菌株組合對發(fā)酵乳貯藏特性的研究，找到后酸化最弱的乳酸菌組合，最后通過復(fù)合發(fā)酵劑凍干制備條件的優(yōu)化，得到弱后酸化復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑。
嗜熱鏈球菌(cgmccno：2525)即下文中的grx02，在中國專利zl200810023012.0中已公開。
實(shí)施例中所使用的其他菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離，并保藏，可向公眾提供。它們的公開情況如下
桿菌：lh-1、sh(吳晨呈.發(fā)酵乳乳酸菌篩選及發(fā)酵特性研究[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2013.)，其余桿菌為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌株，為首次分離。
嗜熱鏈球菌：
s937(瓦云超.乳酸菌發(fā)酵特性對發(fā)酵混合乳品質(zhì)影響[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2016.)
90-57、937-1(陳旭嬌.鼠李糖乳桿菌grxl9常溫發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化及其中試[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2014.)393-1、937-1(趙蘭鳳.中藥提取物對lactobacillusrhamnosusgrx10輔助降血脂功效特性的影響研究[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2014.)
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grx90(徐寅.乳酸菌對發(fā)酵豆乳風(fēng)味及抗氧化活性影響研究[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2012.)(徐寅,黃玉軍,顧瑞霞*,等.乳酸菌對發(fā)酵豆乳風(fēng)味成分的影響研究[j].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(5):91-95.)(徐寅,黃玉軍,顧瑞霞*,等.牛乳含量對發(fā)酵豆乳風(fēng)味成分影響研究[j].食品科學(xué),2013,34(04):1-5.)(徐寅,黃玉軍,顧瑞霞*,等.乳酸菌發(fā)酵豆乳體內(nèi)外抗氧化效應(yīng)研究[j].中國乳品工業(yè),2012,40(8):16-19.)
s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7(韓青青.黑米發(fā)酵乳及其體外抗氧化活性[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2012.)(張道寬.乳酸菌凍干發(fā)酵劑的研究[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2009.)
la-573、gp1、la-57、90-mix5054(楊旭.乳酸菌rep-pcr分子鑒別及其與體外細(xì)胞的相互作用[d].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2009.)
1.乳酸菌的篩選
從傳統(tǒng)發(fā)酵劑中篩選獲得的乳酸菌中挑選100株具有良好發(fā)酵特性的乳酸菌，以3％(v/v)接種量接種發(fā)酵，42℃培養(yǎng)，通過凝乳時間、凝乳狀態(tài)和產(chǎn)酸速率等，淘汰發(fā)酵時間過長、凝乳狀態(tài)較差、發(fā)酵乳質(zhì)量較差的乳酸菌，獲得10株乳酸菌，并測定發(fā)酵乳貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行測定，測定其在4℃條件下貯藏第1、5、10、15、21d酸度變化，結(jié)果如表1和2所示。
表1不同瑞士乳桿菌的發(fā)酵性能
注：▲、▼表示同一列數(shù)據(jù)中的最高值和最低值
結(jié)果表明，10株乳酸菌的產(chǎn)酸速率在6.54～12.34°t/h之間，發(fā)酵乳凝膠強(qiáng)度在0.013～0.025kgf·cm-2，活菌數(shù)在7.95～8.42logcfu·ml-1。lh-1生長相對最快，凝乳時間約為6.5h為最短，凝乳時發(fā)酵乳的酸度最高為80.18±1.26°t。sh生長相對最慢，凝乳時間最長約為10.0h。grx09發(fā)酵乳凝膠強(qiáng)度相對最高為0.025kgf·cm-2
表2不同乳酸菌發(fā)酵乳貯藏酸度變化
注:abc表示同一列中數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05)，a1b1c1表示同一行中數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05)。
結(jié)果表明，在4℃貯藏期間，不同乳酸菌后酸化程度各有差異。貯藏20d時，l.helveticuslh-1后酸化最嚴(yán)重，滴定酸度增加了28.81°t，l.helveticusgrx09和sh發(fā)酵乳滴定酸度分別為88.94°t和88.79°t，酸度分別增長了23.82°t和20.85°t，后酸化相對較弱。
綜合乳酸菌的產(chǎn)酸速率、凝乳時間、凝膠強(qiáng)度及貯藏期間酸度，選擇后酸化較弱的grx09和sh，以及后酸化較強(qiáng)的lh-1做對照。
2.乳酸菌鑒定
2.1乳酸菌生理生化鑒定
根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，對上述篩選出的3株乳酸菌進(jìn)行生理生化指標(biāo)及糖發(fā)酵初步鑒定，結(jié)果如表3-2所示。
表3菌株生理生化鑒定結(jié)果
注：“+”表示≥90％菌株陽性，“－”表示≥90％菌株陰性，“d”表示80-90％菌株陽性
表4菌株糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果
注：“+”表示≥90％菌株陽性，“－”表示≥90％菌株陰性，“d”表示80-90％菌株陽性
從表3可以看出，所有的菌株都是革蘭氏陽性菌株，菌體形狀為鏈球、雙球、長桿、短桿等，接觸酶陰性，硝酸鹽還原陰性，無運(yùn)動，不液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)吲哚。j結(jié)合表3和表4可知，菌株lh-1、grx09、sh發(fā)酵甘露糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖，并在15℃不生長，初步鑒定為瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus)。
2.2api鑒定
利用api50chl系列鑒定試驗(yàn)條對3株益生菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表5所示。
表5api50chl系統(tǒng)鑒定結(jié)果
注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。
將api鑒定產(chǎn)生的生化圖譜提交數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線比對，可以得出此株乳酸菌的菌種名稱及鑒定率，結(jié)果見表6。
表6api比對結(jié)果
2.3乳酸菌的16srrna測序鑒定
提取細(xì)菌的總dna，并對菌株的16srrna序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過電泳及凝膠成像，得到擴(kuò)增條帶，如圖1所示。
將乳酸菌的16srrna的pcr產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。登陸genbank，進(jìn)入blast，提交測序所得到的16srrna序列進(jìn)行在線比對，比對結(jié)果如表7所示，與api鑒定結(jié)果一致。
表716srrna比對結(jié)果
結(jié)合生理生化試驗(yàn)、api試劑條鑒定及16srrna測序鑒定，表明菌株lh-1、grx09和sh均鑒定為瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus)。
3.不同菌株組合及后酸化特性研究
將后酸化強(qiáng)弱程度不同的l.helveticuslh-1、grx09、sh分別與21株嗜熱鏈球菌進(jìn)行組合，按照6×106cfu/ml的總接種量且嗜熱鏈球菌與瑞士乳桿菌活菌數(shù)比2:1接種發(fā)酵，42℃發(fā)酵至發(fā)酵終點(diǎn)(ph4.6)，測定不同乳酸菌發(fā)酵乳貯藏21d的后酸化度即滴定酸度的增加值，結(jié)果如表8所示。
表8不同菌株組合發(fā)酵乳后酸化度
注：▲、▼表示同一列數(shù)據(jù)中的最高值和最低值
結(jié)果表明，不同菌株組合發(fā)酵乳后酸化度各有差異，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳后酸化相對于瑞士乳桿菌單菌發(fā)酵乳較弱。l.helveticuslh-1后酸化最強(qiáng)，20d內(nèi)發(fā)酵乳滴定酸度升高了約28.81°t。菌株組合a1、a2和a3發(fā)酵乳后酸化度顯著小于其他菌株組合，其中菌株組合a2即grx09與grx02混合發(fā)酵乳后酸化相對最弱，貯藏21d后，發(fā)酵乳酸度升高約13.35°t，確定l.helveticusgrx09與s.thermophilusgrx02為最佳弱后酸化菌株組合。
4.菌株比例對菌株組合的發(fā)酵及發(fā)酵乳貯藏特性的影響
調(diào)整菌株組合a2中瑞士乳桿菌grx09與嗜熱鏈球菌grx02的活菌比例，以6×106cfu/ml的總接種量接種發(fā)酵，42℃發(fā)酵至ph約為4.6，測定發(fā)酵終點(diǎn)所用時間、滴定酸度、ph值、活菌數(shù)、感官評分以及發(fā)酵乳4℃貯藏期間滴定酸度、ph活菌量的變化，grx09與grx02混合比例以及測定結(jié)果如表9和10所示。
表9不同乳酸菌組合的發(fā)酵特性比較
注：abc表示同一列中數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05)
結(jié)果表明，組合乳酸菌發(fā)酵牛乳的發(fā)酵時間范圍是6.0～7.7h，平均產(chǎn)酸速率在9.76～11.31°t/h之間。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸速率比單一菌株發(fā)酵產(chǎn)酸速率要高，發(fā)酵時間相對較短，且隨s.thermophilusgrx02活菌量的升高，復(fù)合乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸速率呈下降趨勢，而發(fā)酵乳的黏度則呈增高趨勢。菌株組合ⅲ發(fā)酵產(chǎn)酸速率為10.63°t/h，處于中等水平，但是其發(fā)酵乳感官評分相對最高。
進(jìn)一步測定不同乳酸菌組合發(fā)酵乳4℃貯藏1、5、10、15、21d滴定酸度、ph以及活菌量的變化，確定grx09與grx02后酸化較弱的最佳比例，結(jié)果如表10所示。
表10發(fā)酵乳貯藏期間滴定酸度、ph和脫水縮合能力變化
注:abc表示同一列中數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05)，a1b1c1表示同一行中數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05)。
結(jié)果表明，貯藏21d后，菌株組合ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅳ發(fā)酵乳的滴定酸度分別升高了21.69°t、21.81°t、12.59°t、14.85°t和12.88°t，菌株組ⅲ后酸化相對最弱，并且隨著s.thermophilusgrx02活菌量的升高，發(fā)酵乳的后酸化呈下降趨勢。貯藏21d后，發(fā)酵乳的活菌數(shù)在108cfu/ml以上，其中ⅲ組發(fā)酵乳活菌量相對最高，說明菌株組合ⅲ即l.helveticusgrx09與s.thermophilusgrx02的活菌比為1:2，有相對較高的產(chǎn)酸速率且后酸化較弱，其發(fā)酵乳貯藏期間活菌量較高，發(fā)酵乳產(chǎn)品酸度增長小于13°t。
綜合乳酸菌發(fā)酵特性、發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)以及貯藏特性，選擇菌株組合ⅲ，即l.helveticusgrx09與s.thermophilusgrx02的活菌數(shù)比1:2為最佳弱后酸化復(fù)合發(fā)酵劑。
5.應(yīng)用實(shí)施例
實(shí)施例1：利用瑞士乳桿菌grx09與嗜熱鏈球菌grx02制備發(fā)酵乳
將活化2代后的乳酸菌grx09和grx02培養(yǎng)物分按3％(v/v)接種量接種于經(jīng)95℃/5min熱處理的10％(w/w)復(fù)原脫脂乳中，于37℃培養(yǎng)10h，冷卻4℃用于制備發(fā)酵劑，兩種發(fā)酵劑的活菌數(shù)均約為108cfu/ml。將12％(w/w)復(fù)原全脂乳加熱至50℃左右，加入6％(w/w)蔗糖，經(jīng)充分溶解后將復(fù)原全脂乳預(yù)熱到60℃左右，在20mpa壓力下進(jìn)行均質(zhì)。然后將復(fù)原全脂乳在95℃/5min條件下熱處理，待冷卻至38℃，按grx09和grx02活菌比為1:2，總接種量為6×106cfu/ml的接種量接入兩種發(fā)酵劑，在42℃下發(fā)酵至凝乳，冷卻后于4℃貯藏，即得到后酸化較弱的發(fā)酵乳。
實(shí)施例2：利用瑞士乳桿菌grx09與嗜熱鏈球菌grx02制備發(fā)酵脫脂乳
6kg脫脂奶粉+3kg蔗糖+41kg水溶解制成12％(w/w)復(fù)原脫脂乳，95℃，5min熱處理，冷卻至42℃，按照活菌比為1:2，總接種量為6×106cfu/ml的接種量接種乳酸菌grx09和grx02發(fā)酵劑，42℃發(fā)酵至凝乳，即得50kg后酸化較弱的發(fā)酵脫脂乳。
實(shí)施例3：利用瑞士乳桿菌grx09與嗜熱鏈球菌grx02制備發(fā)酵脫脂乳
42kg的脫脂乳粉，用50℃的水溶解制備成復(fù)原脫脂乳350kg，經(jīng)充分溶解后，，將復(fù)原脫脂乳在95℃/5min條件下熱處理，待冷卻至37℃，按活菌比為1:2，總接種量為6×106cfu/ml的接種量接種乳酸菌grx09和grx02發(fā)酵劑，在37℃下發(fā)酵24h左右，終點(diǎn)酸度控制在160°t左右，加入650kg經(jīng)110℃/5s殺菌的糖、穩(wěn)定劑混合溶液(該混合溶液的組成為12％蔗糖、0.1％單甘脂、0.1％蔗糖酯和0.4％果膠)，混合后預(yù)熱至60℃，在20mpa壓力下進(jìn)行均質(zhì)，然后在75℃/15s條件下熱處理，冷卻至15℃左右，采用無菌灌裝，即得1000kg瑞士乳桿菌grx09與嗜熱鏈球菌grx02混合發(fā)酵乳飲料。